黑树莓花色苷的提取及抗氧化性能的研究

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黑树莓(哈瑞特兹,Heritage)是我国大规模种植和出口的主要品种,也是一种营养丰富的浆果,尤其富含花色苷,可作为天然食药品起到独特的保健和疾病预防功能。花色苷具有优异的自由基清除能力,在抗氧化、抗炎、抗肿瘤,降血糖等方面都有应用。鉴于黑树莓在我国具有很高的药用价值和商业价值,黑树莓中花色苷含量优于其他颜色树莓,因此本文选择黑树莓作为研究对象。分析黑树莓的组成成分,计算其花色苷含量、色价,并利用响应面法优化提取工艺,为科学提取哈瑞特兹黑树莓提供理论参考。本文不仅是通过体外抗氧化检测,还通过黑树莓在细胞水平抑制氧化应激实验联合评价黑树莓的抗氧化性能,为综合开发利用哈瑞特兹黑树莓提供更加准确可靠的理论依据。本课题主要研究工作如下:(1)以黑树莓为实验原料,乙醇-水溶液为提取溶剂,不同乙醇浓度、水浴时间、提取温度、料液比为变量设计单因素实验,并结合响应面优化提取工艺,得到的优化参数为:乙醇浓度33.58%,提取时间66.32 min,料液比6.92 m L/g。以预测的最佳提取参数进行实际验证,得到响应面优化和实际操作的相对误差为2.75%。纯化后黑树莓花色苷(BRE)色价为34.13,比纯化前提高了15.95倍。花色苷含量为756±11 mg/100g,远高于Bristol黑树莓(325.5 mg/100g),烟73葡萄(313.9mg/100g)和黑豆皮(383.6 mg/100g)等花色苷含量。(2)通过HPLC-MS联用技术对自提取黑树莓花色苷进行分析,得到以下五种花色苷成分,即矢车菊素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-阿拉伯糖苷(Cyanidin-3-arabinose)、矢车菊素-3-丙二酰基葡萄糖苷(Cyanidin-3-malonylglucoside)、矢车菊素-3-芸香糖苷(Cyanidin-3-Rutinoside)、矢车菊素-3-(6′′-咖啡酰槐糖苷)-5-葡萄糖苷(Cyanidin-3-(6′′-cafteoyl sophoroside)-5-glucoside),其中矢车菊素-3-葡萄糖苷是黑树莓中最主要的花色苷成分,占全部花色苷成分的69.32%。这些组成成分是植物中最常见的花色苷,其糖基化基团和酰化结构均具有强抗氧化性。(3)在体外还原能力、DPPH自由基、ABTS自由基、·OH和O2-·清除能力实验中,黑树莓花色苷呈现出优异的还原能力和自由基清除能力。花色苷在·OH和O2-·清除能力的实验中测得IC50分别为41.79μg/mL、37.54μg/m L,均优于海南蒲桃(IC50分别为151.0±5.0μg/m L,85.0±5.0μg/m L)。在DPPH自由基和ABTS自由基清除能力测定中,它们的IC50分别为14.11μg/mL、14.95μg/m L,远远低于黑树莓酒(IC50分别为130μg/mL,198μg/m L)。黑树莓花色苷对这4种自由基的清除能力强弱顺序为DPPH>ABTS>O2-·>·OH。(4)根据细胞抗氧化方法(CAA),建立一个环氧丙酰胺(GA)诱导食管癌EC-109细胞的氧化损伤模型。从细胞凋亡,还原型谷胱甘肽减少,活性氧释放,线粒体膜电位变化,细胞核损伤五个方面评价黑树莓花色苷在细胞内的抗氧化性能。实验表明,环氧丙酰胺(8 mM)可导致EC-109细胞存活率显著降低;还原型谷胱甘肽(GSH)消耗增加;细胞核固缩、破碎,甚至形成凋亡小体;活性氧(ROS)激增;线粒体膜电位(MPP)下降。然而黑树莓花色苷(10μg/mL、40μg/mL、80μg/mL)前处理能明显降低环氧丙酰胺诱导的细胞死亡;抑制GSH的消耗;大大减少ROS的产生;修复细胞线粒体膜,恢复其膜电位;使细胞核形态变得饱满,减少凋亡小体的出现,保护细胞核免受损伤。说明黑树莓花色苷能够较好地保护环氧丙酰胺诱导EC-109细胞的氧化应激损伤,黑树莓花色苷在细胞内也具有优良的抗氧化性能。
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