Axud1(Axin1 up-regulated)基因是近年来在人类结肠癌细胞中鉴定出的受Wnt信号通路中的轴蛋白AXIN1上调表达的基因。该基因含有五个外显子，其编码产物为分子量63kD的细胞核内蛋白，该基因在肺癌、肾癌、肝癌和结肠癌中的表达较相应的正常组织均明显降低。通过GENK BANK上BLAST的搜索结果表明，AXUD1与TGF-β诱导的凋亡蛋白2、12(TAIP-2、TAIP-12有较高的同源性，提示axud1可能是一个具有肿瘤抑制功能的基因，并可能在TGF-β诱导的细胞凋亡中起着重要作用。 为了进一步研究AXUD1在人类肿瘤发生中的作用及axud1基因的表达状况与TGF-β介导的信号通路的关系，本实验研究分为三个部分：(1)axud1基因cDNA全长编码区的克隆和HA表位标记的axud1基因表达载体的构建；(2)探讨肝癌细胞HepG2和肺腺癌SPC-A1细胞中TGF-β1诱导的axud1基因表达的时间、剂量效应以及诱导表达的可能机理，并研究AXUD1的过表达对细胞周期和细胞凋亡相关蛋白表达的影响；(3)axud1原核表达载体的构建及其在大肠杆菌中的表达。 本实验的主要结果和结论如下： 1．利用一步法RT-PCR成功地从人类外周血淋巴细胞中克隆出axud1基因编码区cDNA，并将其构建入真核表达载体中，编码的HA-AXUD1融合蛋白带有流感病毒凝血素HA的表位标记肽段。重组质粒经PCR、酶切分析和序列测定证明是正确的，这为进一步研究AXUD1蛋白在肿瘤细胞中的功能提供了有用的工具。 2．在HepG2和SPC-A1细胞中，TGF-β1能明显诱导这两种细胞中的axud1基因的表达，而且表现出时间和浓度的依赖效应。同时，利用 第一军医大学博士学位论文蛋白质合成的特异抑制剂还发现，TGF一pl诱导的axudl基因的表达过程需要新的蛋白质的合成，提示axudl基因是TGF一p信号通路的一个主要靶分子。 3.野生型的Smad3的过表达能上调H即G2细胞中axudl基因mRNA的表达，而Smad3蛋白的显性失活突变子Smad3(D4O7E)却下调其表达。另一方面，TGF一pl诱导的axudl基因mRNA的表达并不受MAPK信号通路的MEKI/2和p38两个激酶抑制剂的抑制，这一结果提示TGF一pl诱导的:xudl基因的表达需要Smad3而非依赖于MAPK信号通路的激活。 4.分别将质粒peDNA3.1和peDNA3.1/ha一axudl转染HepGZ以比较两组细胞在有无TGF一旦1刺激下对细胞周期和细胞凋亡相关蛋白表达的差异。在无TGF一pl刺激下，HA一AXUDI蛋白的过表达与对照质粒转染的细胞相比，能降低Bax的表达并显著下调p53蛋白的表达，相反，却增加C一Mye蛋白的表达。然而，对BCI一XL和Caspase一3的表达两组细胞没有明显的差异。另一方面，在TGF一pl刺激下，HA一AXUDI蛋白过表达细胞组中Bcl一XL和C一Myc蛋白的表达却下降，而Bax蛋白表达反而增加，Caspase一3和p53的水平没有改变。而空载体转染细胞组只是C一Myc蛋白的表达略有升高，其他蛋白的表达水平与无刺激作用时相当。另外，流式细胞仪检测表明，HA一AXUDI蛋白的过表达细胞组较空载体转染细胞组，G0/G1(%)上升，而S(%)下降，说明细胞阻滞于G1期。这一系列的结果提示AXUDI蛋白通过不同的方式上调或下调细胞周期和凋亡相关蛋白的表达而增强TGF一pl诱导的肿瘤细胞生长的抑制和促进凋亡的发生。 5.axudl cDNA片段成功地克隆入原核表达载体pQE30，并用IPTG诱导出AXUDI融合蛋白的表达，这为进一步纯化AXUDI蛋白，研究AXUDI蛋白的免疫组织化学定位和结构功能奠定了基础。