第一章 颗粒细胞中低表达的lncRNA HCP5在早发性卵巢功能不全中的作用与机制研究研究目的:早发性卵巢功能不全(Premature ovarian insufficiency,POI)是一种严重影响女性身心健康的常见生殖障碍性疾病,主要表现为月经异常(闭经、月经稀发或频发)、血清促性腺激素水平升高和雌激素波动性下降,发病率约为1%～5%。由于卵巢功能衰竭绝大多数情况下不可逆转,且目前临床尚无有效的治疗手段能够改善或挽救POI患者卵巢功能,导致其生育问题成为棘手难题。因此,病因学研究对POI的早期预警、早期诊断、早期干预具有重要意义,一直是研究的热点和难点。POI常见病因包括遗传因素、自身免疫异常、医源性损伤以及感染等,但大多数患者病因仍不明确。目前POI致病基因研究主要集中于蛋白编码区域,对于占人类基因组98%以上的非编码区域关注较少,研究非编码RNA打破了传统遗传学的束缚,丰富了基因表达调控方式,是目前主要研究方向之一。长非编码RNA(Long noncoding RNA,lncRNA)是一类长度大于200nt的非编码RNA,在多种生物学进程和病理过程中发挥着重要作用,尤其是在肿瘤中的作用日益受到重视。目前lncRNA对卵巢功能的调控作用还不明确,是否参与POI的发生发展过程尚未见报道。本研究拟借助临床资源与高通量芯片技术,探讨lncRNA参与的表观遗传学调控在POI中的作用及机制,以期寻找新的早期诊断靶点和临床治疗策略。研究方法:本研究纳入生化异常期POI(Biochemical POI,bPOI)患者以及年龄匹配的健康对照各10例,收集其卵巢颗粒细胞;利用Arraystar Human LncRNA高通量芯片方法检测差异表达的lncRNA,初步筛选并在独立扩大样本中进行qRT-PCR验证。在功能实验中,使用3种颗粒细胞来源的细胞系KGN、COV434和SVOG检测lncRNA HCP5对颗粒细胞DNA损伤修复功能和凋亡水平的影响。最后,借助荧光原位杂交、染色质免疫共沉淀、RNA pull down等实验技术阐明HCP5参与POI发生发展的分子机制。结果:LncRNA芯片共鉴定出159个差异表达的lncRNA,其中,位于POI致病基因MSH5上游276kb处的lncRNA HCP5在bPOI患者颗粒细胞中表达显著下调。功能研究提示,低表达的HCP5致使ILF2与YB1结合受限,进而影响ILF2介导的YB1入核,从而减少其在MSH5启动子区的募集,在转录水平抑制MSH5的表达,导致颗粒细胞的DNA损伤修复功能障碍,凋亡增加,卵泡耗竭加速。结论:本研究在bPOI患者颗粒细胞中发现具有明确功能的lncRNA HCP5,并阐明其通过调控DNA损伤修复机制,导致卵泡过度闭锁,参与POI的发生。该研究揭示了 lncRNA参与的表观遗传调控在DNA损伤修复和POI中的重要作用,首次在POI病因学研究中提出了非编码RNA通过调控经典致病基因导致POI的表观遗传调控机制,不仅丰富了对已知POI致病基因功能的理解,而且进一步拓展了 POI病因学研究方向。第二章 颗粒细胞中低表达的lncRNA GCAT1在早发性卵巢功能不全中的作用与机制研究研究目的:POI是严重影响女性身心健康的常见生殖障碍疾病之一,近年来发病率呈明显上升趋势。在我国,近400万女性因卵巢功能衰退面临“一孩难求、二胎无望”的困境,严重影响家庭稳定与社会和谐。POI不仅导致不孕,且能引起多种远期并发症,造成全因死亡率和癌症死亡率增高。POI病因复杂,由于卵巢功能衰退进展迅速,且多数情况下不可逆转,而临床缺乏有效的早期诊治手段,绝大多数患者来诊时已错过最佳生育时机,陷入“巧妇难为无米之炊”的困境。因此病因研究对POI的早期预警、早期诊断、早期干预具有重要意义。在人类基因组中,大多数转录本是非编码RNA,能够编码蛋白的信使RNA(mRNA)仅占3%左右。而在非编码RNA中,长链非编码RNA(lncRNA)在机体多种生理过程及疾病中的作用逐渐受到重视。LncRNA敲除、过表达或突变,已被证明与多种人类疾病有关,但lncRNA是否参与POI的发生发展过程仍需要更多的实验证据和临床数据的支持。值得注意的是,既往有学者已经鉴定出功能性的lncRNA可以控制颗粒细胞的基因表达和生物学行为,从而导致多种女性生殖疾病,例如多囊卵巢综合征、子宫内膜异位症等。但是,lncRNA在POI中的作用研究十分有限。于是在本章节中,我们在前一章节芯片结果基础上,继续寻找POI患者颗粒细胞中差异表达lncRNA,并阐明其调控卵巢功能的具体机制。研究方法:在前一章节芯片结果基础上,按照lncRNA长度、初始表达丰度、变化倍数、p值,以及不与编码转录本重叠的筛选标准,选择差异最显著的7个lncRNA,在独立的24例bPOI患者和24例对照女性中进行qRT-PCR扩大样本验证,并结合卵巢储备临床指标进行相关性分析。在功能实验中,在颗粒细胞来源的细胞系中检测lncRNA GCAT1对细胞增殖能力的影响,并利用荧光原位杂交、RNA pull-down、RNA结合蛋白免疫共沉淀等技术进行后续的分子机制研究。结果:在芯片检出的差异表达lncRNA中,初步筛选出变化倍数最大的7个lncRNA进行扩大样本验证,结果显示其中3个在bPOI患者颗粒细胞中表达显著下调。相关性分析显示,lncRNAGCAT1与卵泡刺激素(FSH)和抗苗勒管激素(AMH)水平显著相关。进一步机制研究发现GCAT1能够与p27mRNA竞争性结合PTBP1蛋白,GCAT1下调导致PTBP1与p27mRNA的IRES位点结合增加,促进p27蛋白翻译起始过程,从而抑制颗粒细胞周期进程和增殖能力,导致生长期卵泡闭锁,最终发生POI。结论:发现bPOI患者颗粒细胞中低表达的lncRNAGCAT1与卵巢功能相关。GCAT1表达下降会导致其直接结合蛋白PTBP1与p27 mRNA结合,起始IRES介导的翻译过程,促进p27蛋白表达,进而抑制颗粒细胞周期进程和增殖能力,参与POI的发生发展过程。