本课题组已经成功从中药鼠妇Armadillidium vulgare Latreille中分离出鼠妇纤溶酶,其相对分子质量为3.849×10⁴,前期对其酶学性质研究发现,鼠妇纤溶酶的最适反应温度为40℃,最适反应pH值为7.0;对甲苯磺酰-L-赖氨酰氯甲酮（TLCK）、乙二胺四乙酸（EDTA）、乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA）、苯甲基磺酞氟（PMSF）抑制作用相对较弱,剩余纤溶酶活力均高于75%,而aprotinin、pepstain A对鼠妇纤溶酶纤溶活性则完全抑制;而且其口服有效。为使其发挥更广泛的用途,本实验通过模拟胃肠环境对鼠妇活性粗蛋白进行酶解后再分离而获得相对分子质量更小、效价更高的蛋白或多肽。在蛋白质组学分析中,胰蛋白酶是应用最多的蛋白酶,由于许多蛋白质富含赖氨酸和精氨酸,因而经胰蛋白酶作用之后得到的片段很适合用于质谱分析蛋白质的氨基酸排列。本文以鼠妇为研究对象,首次尝试对鼠妇纤溶粗蛋白进行在模拟胃肠环境中酶解,接着对具有纤溶活性的酶解产物进行分离纯化。具体的研究内容和结论如下:1.分别研究pH值、温度、金属离子、酶抑制剂和表面活性剂四个因素对模拟胃肠环境中胃蛋白酶和胰蛋白酶纤溶活性的影响,以纤维蛋白平板为检测指标,成功获得较佳的酶失活工艺。为了使较佳的酶失活工艺能够得到更广泛的应用,进一步研究较佳的酶失活工艺对目前市场上常用的如尿激酶和蚓激酶,以及本课题组前期分离纯化得到的鼠妇纤溶酶PSLTro01的纤溶活性影响,并获得最优失活工艺,即在保持尿激酶、蚓激酶和鼠妇纤溶酶稳定性的前提下使胃蛋白酶和胰蛋白酶的纤溶活性有效失活,所获得的最佳失活工艺为:胃蛋白酶的最优失活方案为pH 6.0～8.0;胰蛋白酶的最优失活方案为质量浓度25 mg/mL TLCK和浓度1 mmol/L EDTA的混合制剂。2.研究鼠妇纤溶粗蛋白在模拟胃肠环境中酶解过程。首先,比较酶解前后部分体内外药效学,酶解后的酶解物的纤溶活性稍强于酶解前的粗蛋白,酶解前的粗蛋白主要作用于凝血过程中内源性凝血途径和共同凝血途径,延迟血浆凝固时间,且在一定范围内,活性蛋白的浓度与抗凝作用存在着量效关系。酶解后的酶解物均作用于凝血过程中内源性、外源性、共同凝血途径,而且各项结果均优于粗蛋白组。然后,探索在模拟胃肠环境中酶解工艺条件对有效部位的活性影响,分别从胃蛋白酶酶解时间、胰蛋白酶酶解时间、酶解温度、酶与底物比例四个因素设计了正交实验,得出了酶解最优工艺:酶与底物比例1:1,胃蛋白酶酶解时间4h,胰蛋白酶酶解时间4h,酶解温度40℃。最后,在最优酶解工艺条件下,比较了酶解前后SDS-PAGE凝胶电泳条带的变化,发现在各分子量段均有新的物质产生。3.对第二部分所获得的高活性酶解粗提物进行分离纯化,分别通过HiTrap Capto Q（100mL）离子交换层析,Sephacryl S-200 HR,Superdex 75 pg凝胶过滤层析等纯化方法进行分步纯化,最后经过Amicon（?）ultra-15（3K、5K和10K）超滤离心管浓缩,最终获得纯化产物（PSLTro02）并对其分子特征（包括纯度,分子量,氨基酸序列比对）进行表征。HPLC纯度检测其纯度达到了 93.86%,PSLTro02经过MALDI-TOF MS质谱法测定,蛋白的相对分子量为8480.55 Da,这与SDS-PAGE结果基本吻合,与同种属Porcellio scaber和Armadillidium vulgare匹配度均低于20%。4.对PSLTro02进行酶学性质研究,研究发现:PSLTro02的最适反应pH为7.0,在中性和碱性环境下的稳定性高于在酸性环境下的稳定性;PSLTro02的最适反应温度为40℃,在20℃环境中,可以长时间保存,高于50℃后,PSLTro02不能长时间保存;Na⁺,K⁺,Mg²⁺对PSLTro02纤溶活性没有影响,Cu²⁺,Mn²⁺,Fe²⁺,Ca²⁺,Zn²⁺,Al³⁺,Fe³⁺均有不同程度抑制其纤溶活性,尤其是Fe²⁺,Fe³⁺明显抑制其活性;PepstainA,KTI,SBTI,Aprotinin在各浓度下对PSLTro02纤溶活性较大,在PMSF,TLCK,TPCK,EDTA,EGTA,SDS各浓度中PSLTro02的纤溶活性基本没有受到影响;PSLTro02的特异性水解底物为S-2251,具有组织型纤溶酶的特性;胃蛋白酶和胰蛋白酶最优的失活条件同样也适用于PSLTro02纤溶活性蛋白。5.通过体内外药效学实验,发现PSLTro02纤溶活性和抗凝活性都稍强于PSLTro01,而且具有显著性差异。