混合模式色谱(MMC)是利用蛋白质与固定相配基之间多种相互作用力来进行分离的,可提供两种以上的作用力用于溶质的分离。与单一色谱分离模式相比,MMC具有更高的选择性和吸附量。近年来,研究者对于MMC的合成、分离机理以及应用等方面的研究越来越多。然而,为了合成具有双功能特性的MMC分离介质,配基的筛选尤为重要。本文合成了一系列的强阴/疏水(SAX/HIC)双功能分离介质,对其吸附性能、混合保留机理以及对蛋白质的分离等进行了详细的研究,结合疏水性常数,讨论了配基疏水性对双功能分离介质在离子交换(IEC)和疏水(HIC)两种分离模式下对蛋白质分离的影响,并将其应用于实际生物样品的分离纯化。全文包括以下四个部分:1.文献综述介绍了混合模式色谱与传统模式色谱相比的优势,重点评述了不同配基类型组合的混合模式固定相的制备及应用。2.双功能分离介质的保留机理以及吸附性能采用本课题组已经成功合成的SAX/HIC和SCX/HIC两种双功能分离介质,利用SDT理论对其混合保留机理进行了解释,洗脱曲线呈现“U”型,说明固定相具有IEC和HIC的性质,比较“U”型曲线形状,如果固定相在两种模式下均有好的分离能力,曲线就会比较对称。同时,测定了不同模式下固定相对蛋白质的吸附量,在IEC模式下,断续和连续前沿色谱法测得的饱和吸附量qm分别为112.63mg/mL和87.71mg/mL,KL分别为7.42和9.50;在HIC模式下,连续前沿色谱法测得的饱和吸附量qm为270.27mg/mL,KL为2.64。讨论了不同的盐浓度对吸附量的影响,随着盐浓度的增大,吸附量也呈“U”型,利用Langmuir和Freundlich吸附等温式对实验数据进行了拟合,比较可知Langmuir吸附等温式拟合效果更好一些。3.不同配基对双功能分离介质对蛋白质保留的影响选择疏水性不同的烷基链,包括甲基、乙基、丙基、丁基、庚基、癸基、十四烷基和十八烷基八种配基,合成了一系列的SAX/HIC双功能分离介质,在IEC和HIC两种分离模式下对标准蛋白质进行了分离,发现随着配基疏水性的增强,蛋白质的保留逐渐增强,峰形逐渐变宽;另外,配基的疏水性也影响分离介质的选择性。在两种模式下,苄基为配基的双功能分离介质,对蛋白质的分离效果最好,峰形也最窄。表明苄基为疏水配基时疏水作用和静电作用相匹配,这样才能在两种模式下均获得良好的分离能力。结合配基疏水性常数,从理论上对双功能分离介质配基的筛选提出了理论指导。另外,测定了这八种双功能分离介质对蛋白质的质量回收率和活性回收率,结果表明配基疏水性对其同样有影响,疏水性越强,质量回收率和活性回收率就越小。同时,讨论了蛋白质在其中五种双功能分离介质上的混合保留机理,利用SDT理论对其进行了解释。通过比较蛋白质在不同配基的固定相上的“U”型曲线,可以看出临界点越高,配基的疏水性越强,蛋白质保留强;洗脱范围宽,峰形窄,洗脱范围窄,峰形钝。4.双功能分离介质对蛋清和牛奶中活性蛋白质的分离纯化采用离线和在线二维液相色谱技术,选择以甲基、丁基和十四烷基为疏水配基的SAX/HIC双功能分离介质,对蛋清中的卵白蛋白和卵转铁蛋白进行分离纯化,第一维为SAX模式,第二维为HIC模式,以丁基为配基的双功能分离介质的纯化效果最好,卵白蛋白的纯度达到96%,卵转铁蛋白的纯度达到98%。利用以丁基为配基的双功能分离介质对牛奶中的活性蛋白质进行分离纯化,在SAX模式下,只得到纯度为97%的α-乳清蛋白;在HIC模式下,可得到β-乳球蛋白和α-乳清蛋白,纯度分别为94%和96%。