【摘 要】
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中华鲎是一种古老的海洋生物。中华鲎的先天免疫系统完全依赖于一套独特且有效的凝血系统。凝血系统的凝血级联反应主要由Factor C（FC）、Factor G（FG）、Factor B（FB）以及Proclotting Enzyme（PCE）等4种凝血血蛋白和一种凝固蛋白原组成的。该系统为一种由内毒素激活FC途径,另外一种由（1,3）-β-D-葡聚糖激活FG途径。天然的鲎血制品广泛地应用于药品和食品的
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中华鲎是一种古老的海洋生物。中华鲎的先天免疫系统完全依赖于一套独特且有效的凝血系统。凝血系统的凝血级联反应主要由Factor C（FC）、Factor G（FG）、Factor B（FB）以及Proclotting Enzyme（PCE）等4种凝血血蛋白和一种凝固蛋白原组成的。该系统为一种由内毒素激活FC途径,另外一种由（1,3）-β-D-葡聚糖激活FG途径。天然的鲎血制品广泛地应用于药品和食品的内毒素和真菌葡聚糖的检验、医疗器械、临床医学研究等多个领域。但由于鲎资源过度消耗,导致鲎的数量急剧减少。2019年,中华鲎已经被列入到世界自然保护联盟（IUCN）红色名录——濒危（EN）。因此,鲎试剂的制备需要通过其他的方法替代天然鲎血获得鲎试剂的原材料。本课题实验旨在通过在大肠杆菌工程菌中表达异源蛋白获得凝血蛋白,来构建检测内毒素或（1,3）-β-D-葡聚糖的反应体系,使检测更加灵敏、特异性更强,从而替代提取天然鲎血,解决生产鲎试剂原材料短缺的问题。本论文通过大肠杆菌表达系统分别异源表达FGα、FGβ和PCE等凝血因子蛋白,构建特异性检测（1,3）-β-D-葡聚糖的单一途径反应体系。通过改变诱导条件、与分子伴侣素CpkA共表达、设计融合标签肽等实验方法提高FGα和PCE的可溶性表达。对诱导表达的包涵体进行体外复性实验,利用得到的复性蛋白构建检测（1,3）-β-D-葡聚糖的反应体系,并测定不同凝血因子组合（双因子和三因子）的反应体系的肽酶活性;我们还尝试利用分子伴侣素辅助FGα和PCE体外复性。结果表明,我们在Esherichia coli BL21（DE3）中分别成功表达出FGα、FGβ和PCE重组蛋白,但主要以包涵体形式存在。分子伴侣素在体内/体外都能辅助鲎凝血因子折叠。标签肽/分子伴侣素共表达体系可提高FGα的可溶性表达:FGα’可溶性表达提高2倍;FGα’与分子伴侣素MA4386共表达,可溶性表达提高7.5倍。三种鲎凝血因子蛋白的复性均有活性,在1M和2M的尿素浓度范围内都具有肽酶活性,并在2M尿素环境中活性最高,其中CpkB辅助复性的FG a+PCE双因子检测体系具有最高的（1,3）-β-D-葡聚糖诱导的肽酶活性9.6 U/mg,且高于鲎试剂的比活为0.9 U/mg;此外非葡聚糖糖类无法诱导肽酶活性实验表明双因子检测体系对（1,3）-β-D-葡聚糖的高特异性。本实验成功表达了三种鲎凝血因子蛋白,并应用标签肽/分子伴侣素共表达体系提高了FGα的可溶性表达;最终构建了一个高活力、高特异性地用于检测（1,3）-β-D-葡聚糖反应体系。
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