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植物线粒体区别于动物线粒体的重要特征之一是植物线粒体具有一条对氰化物不敏感的电子传递途径,即抗氰呼吸途径(cyanide-resistant respiration pathway)或称对氰化物不敏感的交替氧化途径(cyanide-insensitive alternative pathway, AP)。电子流通过细胞色素途径,偶联ATP的生成,而电子在细胞色素途径的泛醌处分支,转入交替氧化途径,结合氧气,生成水。该过程并不生成ATP,而是释放热量,由交替氧化酶(alternative oxidase, AOX)所介导。AOX是交替氧化途径的末端氧化酶,位于线粒体的内膜上。在已检测的物种中,大部分植物组织中都含有AOX蛋白。关于交替氧化途径和AOX的生物学功能一直是植物生理学领域中研究的热门课题,除在一些植物(如天南星科植物)开花过程中产热(有利于传粉)外,AOX蛋白的三级结构及很多生物学功能都不是很清楚。本研究从心叶烟中克隆了交替氧化酶基因(NgAOX1a),对其进行了序列比对、表达特性分析。同时,还克隆了NgAOX1a基因的启动子,构建了缺失分析的表达载体,为下一步分析启动子元件奠定了基础。具体结果如下:1、利用反转录-PCR(RT-PCR)从心叶烟(Nicotiana glutinosa)中分离得到一个AOX基因,即NgAOX1a,GenBank注册号为EF523518。该基因cDNA全长1448bp,包括一个1062 bp的开放阅读框(ORF),124 bp的5′非编码区(untranslated region, UTR)和262 bp的3′UTR。ORF编码一个353氨基酸的多肽,包括2个保守的半胱氨酸残基、4个Fe结合位点、5个α-螺旋区和6个保守的组氨酸残基。序列分析发现NgAOX1a与其他物种中的AOX1基因有较高的同源性。NgAOX1a的基因组含有4个外显子和3个内含子,Southern杂交显示NgAOX1a基因为单拷贝基因。2、Northern杂交分析显示NgAOX1a基因可以被各种非生物胁迫条件强烈诱导,如响应防御反应的外源信号分子水杨酸(salicylic acid, SA)和H2O2、外源的三羧酸(tricarboxylic acid, TCA)循环中间代谢物柠檬酸盐,但被乙烯(ethylene, ET)的抑制剂CoCl2抑制表达。此外,NgAOX1a基因还可以被烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus, TMV)、马铃薯X病毒(Potato virus X, PVX)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y, PVY)强烈诱导。根据这些结果,可以推测NgAOX1a可能参与多个信号传导途径,并在防御反应中起一定的作用。3、用NgAOX1a构建正义植物表达载体pBI121-NgAOX1a,采用农杆菌介导的方法,转化烟草(NC89),经卡那霉素筛选获得若干转基因植株。以转空载体的植株作为对照。经过PCR鉴定及半定量RT-PCR分析,证明NgAOX1a在转基因烟草中得到成功表达。4、选取T0代转基因株系的自交种子扩繁,得到T1代转基因植株。在分子鉴定的基础上,初步证明所测试的正义转基因株系在T1代中的遗传基本符合3:1的分离规律。5、通过LA PCR和反向PCR的方法获得NgAOX1基因的启动子序列,GenBank注册号为GQ199607。利用分析软件PlantCARE对其进行分析,发现该序列除了存在典型的TATA box和CAAT box外,还存在SA响应元件、光响应元件、真菌响应元件、胁迫响应元件等一系列可能的诱导调控元件。6、用NgAOX1a的启动子序列进行缺失分析,构建6个正义植物表达载体,采用农杆菌介导的方法,转化拟南芥,经卡那霉素筛选获得部分T0代种子。