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目的:鼻咽癌是来源于鼻咽部黏膜上皮的一种恶性肿瘤,根据世界卫生组织分型标准,可分为角化型和非角化型鳞癌、分化型非角化癌、未分化癌。我国是鼻咽癌的高发国家之一,南方的发病率又高于北方,且以未分化癌为主。放射治疗是鼻咽癌的主要治疗方式,临床疗效良好,但仍有部分患者会产生放疗抵抗,再次放疗效果不佳。FANCD2基因是范科尼贫血家族中的一员,该家族基因参与了DNA损伤修复,构成范科尼贫血通路,FANCD2在该通路中起核心作用。项目组在前期研究中,检测发现复发鼻咽癌患者FANCD2蛋白表达量增高,推测其参与了鼻咽癌放疗抵抗。在此基础上,本实验拟通过细胞实验了解沉默FANCD2表达对放疗前后细胞克隆形成、增殖、周期、凋亡等的影响,探索沉默FANCD2表达提高鼻咽癌CNE-2细胞放疗敏感性的可能性。方法:以鼻咽癌CNE-2细胞作为研究对象,采用RPMI-1640培养基+10%胎牛血清,于37℃、5%CO2、饱和湿度的孵箱中常规培养。实验细胞分为三组:未做任何干预的野生型CNE-2细胞;含有无效序列的对照组细胞CNE-2NC;含有sh RNA-FANCD2干扰序列的实验组细胞CNE-2sh。(1)构建稳定细胞株,用慢病毒感染CNE-2细胞,在荧光显微镜下观察感染效率,嘌呤霉素进行药物筛选一周以上,至无新的死亡细胞为止,获得沉默FANCD2表达的稳定细胞株CNE-2sh和含有无效序列的对照组稳定细胞株CNE-2NC。提取三组细胞中的总RNA,逆转录为c DNA,采用荧光定量PCR实验检测FANCD2 m RNA的表达量;提取三组细胞的总蛋白,利用Western Blot实验检测FANCD2蛋白的表达量;(2)平板克隆实验,将三组细胞CNE-2、CNE-2NC、CNE-2sh接种于6孔板,经过0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy剂量放疗,放疗后继续常规培养7-14天,待细胞生长至肉眼可见的直径约0.1-0.3cm克隆后,终止培养,使用多聚甲醛固定细胞,染色、漂洗,晾干后拍照、观察、计数。在倒置显微镜下对每大于50个细胞的克隆进行计数,计算克隆形成率,使用多靶单击模型和线性二次模型进行拟合,得到存活分数,计算放疗生物学相关参数;(3)细胞增殖实验,上述三组细胞接种于96孔板中,在经过0Gy和6Gy剂量放疗后继续培养,放疗后第24、48、72、96小时,在酶联免疫检测仪上检测每个孔的光密度值,绘制出细胞增殖曲线;(4)细胞凋亡检测,上述三组细胞接种于6孔板中,在经过0Gy和6Gy剂量放疗后继续培养72小时,终止培养,按细胞凋亡检测试剂盒说明书进行Annexin V-PE和7AAD染色后在流式细胞仪上检测细胞凋亡率;(5)细胞周期检测,上述三组细胞接种于6cm培养皿中,在经过0Gy和6Gy剂量放疗后继续培养24小时,终止培养,按细胞周期检测试剂盒说明书进行PI染色后在流式细胞仪上检测细胞周期。结果:(1)沉默效率验证结果,荧光定量PCR结果显示三组细胞FANCD2 m RNA的相对表达量差异具有统计学意义(F=75.035,P<0.05),CNE-2sh组中FANCD2 m RNA表达量(0.254±0.072)显著低于CNE-2组(1.000±0.000)和CNE-2NC组(0.690±0.078);Western Blot结果显示三组细胞中的FANCD2蛋白相对表达量差异具有统计学意义(F=2450.370,P<0.05)。CNE-2sh组中FANCD2蛋白表达量(0.130±0.025)显著低于CNE-2组(1.672±0.028)和CNE-2NC组(1.336±0.013),沉默效率为92.20%;(2)平板克隆形成实验结果,未经过放疗(0Gy)时三组细胞之间克隆形成率无统计学差异(F=0.600,P>0.05);经过放疗(2Gy、4Gy、6Gy、8Gy、10Gy)后三组细胞之间的克隆形成率差异均具有统计学意义,统计值分别为(F=49.132,P<0.05)、(F=590.113,P<0.05)、(F=286.798,P<0.05)、(F=77.167,P<0.05)、(F=27.000,P<0.05),放疗后CNE-2sh组的细胞克隆形成率显著小于CNE-2组和CNE-2NC组;细胞存活曲线显示CNE-2sh组的生存曲线较CNE-2组和CNE-2NC组下移,多靶单击模型拟合得到放疗增敏比=1.44,线性二次模型拟合得到放疗增敏比=1.18,放疗增敏比均>1;(3)细胞增殖实验结果,未经过放疗(0Gy)的情况下,在0h、24h、48h时CNE-2sh组光密度值与CNE-2和CNE-2NC组之间差异无统计学意义,统计值分别为(F=0.303,P>0.05),(F=0.193,P>0.05),(F=0.067,P>0.05),在72h、96h时,三组细胞的光密度值差异有统计学意义,统计值分别为(F=24.148,P<0.05),(F=15.029,P<0.05),CNE-2sh组的光密度值(0.342±0.018,0.671±0.045)显著小于CNE-2组(0.453±0.019,0.900±0.017)和CNE-2NC组(0.411±0.022,0.825±0.075);经过放疗(6Gy)后0h、24h、48h的CNE-2sh组光密度值与CNE-2组和CNE-2NC组之间差异也无统计学意义,统计值分别为(F=0.172,P>0.05)、(F=1.224,P>0.05)、(F=0.444,P>0.05),在72h、96h时,三组间细胞光密度值差异具有统计学意义,统计值分别为(F=88.598,P<0.05),(F=77.371,P<0.05),CNE-2sh组光密度值(0.300±0.009,0.411±0.020)弱于CNE-2组(0.443±0.018,0.634±0.027)和CNE-2NC组(0.402±0.012,0.574±0.021);(4)细胞凋亡实验结果,未经过放疗时,三组细胞间的细胞凋亡率差异具有统计学意义(F=7.218,P>0.05),CNE-2sh组的细胞凋亡率(4.90±0.21)显著高于CNE-2组(3.36±0.89)和CNE-2NC组(3.09±0.59);经过放疗(6Gy)后,三组细胞间的细胞凋亡率差异具有统计学意义(F=30.872,P<0.05),CNE-2sh组细胞凋亡率(19.05±1.99)显著高于CNE-2组(11.26±0.85)和CNE-2NC组(11.08±1.17);(5)细胞周期实验结果,三组细胞在未经过放疗时细胞周期主要分布在G1期和S期,G2期细胞较少,三组细胞在G1期、S期、G2期的比例差异均具有统计学意义,统计值分别为(F=7.555,P<0.05),(F=19.382,P<0.05),(F=27.031,P<0.05)。CNE-2sh组在G1期(38.54±1.29)、S期(41.06±1.24)的比例显著大于CNE-2组(33.78±2.03)、(37.70±0.75)和CNE-2NC组(34.24±1.55)、(36.48±0.72),在G2期的比例(20.07±1.52)显著少于CNE-2组(28.28±1.58)和CNE-2NC组(29.94±2.12);经过放疗后三组细胞的细胞周期分布发生改变,G1期、S期细胞减少,G2期细胞增加,在CNE-2sh与CNE-2和CNE-2NC三组之间差异具有统计学意义,统计值分别为(F=26.785,P<0.05)、(F=10.571,P<0.05)、(F=39.523,P<0.05),CNE-2sh组在G1期(13.64±1.93)、S期(16.56±3.39)的比例显著小于CNE-2组(21.37±1.19)、(24.72±1.53)和CNE-2NC组(21.66±1.35)、(22.86±1.32),在G2期的比例(66.60±0.74)显著大于CNE-2组(53.91±2.70)和CNE-2NC组(55.47±1.75)。结论:(1)sh RNA干扰能够获得稳定沉默FANCD2表达的鼻咽癌CNE-2细胞(CNE-2sh),沉默效率达到预期;(2)沉默FANCD2表达后能够抑制鼻咽癌CNE-2细胞放疗后的克隆形成率;(3)通过多靶单击模型和线性二次模型拟合后计算获得放疗增敏比>1,提示沉默FANCD2表达能够提高鼻咽癌CNE-2细胞的放疗敏感性;(4)沉默FANCD2表达后能够显著抑制鼻咽癌CNE-2细胞放疗前、后的细胞增殖;(5)沉默FANCD2表达后能够显著促进鼻咽癌CNE-2细胞放疗前、后的细胞凋亡;(6)沉默FANCD2表达后能够显著改变鼻咽癌CNE-2细胞的细胞周期分布,放疗后使阻滞在G2期的细胞显著增多,提高了放疗敏感性。(7)本研究通过细胞实验证实sh RNA干扰沉默FANCD2表达能够提高鼻咽癌CNE-2细胞的放疗敏感性,在此基础上继续对沉默FANCD2表达提高鼻咽癌CNE-2细胞放疗敏感性进行动物实验和可能机制的研究,有望为提高鼻咽癌放疗敏感性治疗提供新的靶点和理论基础。