肝细胞性肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)(简称肝癌)是一种常见恶性肿瘤,该病起病隐匿,发病率和死亡率均较高。虽然近年诊疗技术进步使肝癌生存率有了较大提高,但侵袭转移及术后复发依然为影响肝癌预后的主要障碍。因此,探讨明确HCC侵袭转移、术后复发的分子机制将有助于肝癌诊疗水平的突破性进展与提高。越来越多证据显示,肿瘤微环境参与肝癌侵袭转移调控,细胞外基质(ECM)是细胞周边微环境的重要组成部分,对正常细胞功维持能提供结构支撑及重要生化及物理信号。细胞外基质蛋白过度沉积及构像变化产生胞外基质硬度(matrix stiffness)增加,其所产生的力学信号可通过破坏细胞表面力学平衡引起一系列细胞生物学行为改变。胞外基质硬度变化可在包括肿瘤在内的多种疾病进展中发挥作用：目前已知其异常增加可影响肝癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、神经胶质瘤等肿瘤预后。近年来,一些研究显示胞外基质硬度变化在肿瘤细胞增殖、运动、侵袭中起重要作用。一般认为,胞外基质硬度增加通过细胞表面整合素聚集将产生的力学信号转导进入胞内影响细胞生长及细胞因子分泌；亦可通过细胞骨架重塑影响细胞运动。胞外基质硬度增加在乳腺癌、卵巢癌等肿瘤中的作用及机制已得到部分阐明,但其参与肝癌侵袭转移的调控机制目前仍知之甚少。临床研究资料表明,80%肝癌患者有肝纤维化或肝硬化背景,且伴肝硬化的肝癌患者中位生存期明显下降,胞外基质硬度变化与肝癌发生发展关系密切。因此,聚焦胞外基质硬度变化与肝癌侵袭转移关系研究,无疑会对肝癌侵袭转移机制最终阐明产生积极影响。本课题旨在通过建立不同肝基质硬度背景大鼠肝癌模型,观察肝脏基质硬度变化对肝癌恶性生长及侵袭转移的影响；同时通过建立不同基底硬度细胞培养平台,探索胞外基质硬度变化影响肝癌细胞侵袭转移相关分子机制(VEGF调控、EMT发生等),为从物理微环境角度诠释肝癌侵袭转移作用机制提供新理论和实验基础。第一部分用于研究基质硬度影响肝癌的体内、体外实验技术平台建立及不同肝基质硬度背景大鼠肝癌模型侵袭转移特征分析目的建立用于研究基质硬度影响肝癌的体内、体外实验技术平台,分析不同肝基质硬度背景大鼠肝癌模型侵袭转移特征的改变。方法应用不同剂量四氯化碳腹部皮下注射,诱导不同肝基质硬度Buffalo大鼠模型,然后肝脏原位移植皮下瘤源(大鼠肝癌细胞McA-RH7777皮下注射)联合造模,形成具有不同肝基质硬度背景大鼠肝癌模型。对所获模型肝癌组织基质硬度、恶性病理特征(包括组织病理,肝功能,胶原丰度及交联,肿瘤增殖,肺远端转移及侵袭转移关联基因等)进行分析。体外细胞实验技术平台建立以聚丙烯酰胺凝胶交联度差异呈现的硬度变化来模拟组织硬度改变,以基质蛋白I型胶原包被提供生物基质界面,将两者有机结合形成具有不同基底硬度的细胞培养平台,观察细胞形态、运动及侵袭关联基因表达。结果随肝基质硬度增加,肝肿瘤生长(大小、湿重)、侵袭转移能力(肺转移)均明显增强；增殖指标Ki-67在肝癌细胞中表达增高；肝癌组织中侵袭转移关联基因MMP9, MMP2, CD44, SPP1, Integrinβ1表达明显上调：基质蛋白丰度及交联指标COL1, LOX表达明显上调；肝基质硬度背景不同大鼠肝癌的肝功能评估显示,肝基质硬度增加,肝功能变差(血清ALT, AST, ALP, GGT水平升高,白蛋白浓度降低,且肝癌组织中AFP表达升高),同时肝癌组织中Integrinβ1、FAK表达上调。体外细胞培养平台显示,肝癌细胞随基底硬度增加,细胞伸展面积增大,诱导伪足伸出,侵袭转移关联基因MMP9, MMP2, CD44, SPP1表达上调。结论用于研究基质硬度影响肝癌的体内、体外实验技术平台被成功建立。高肝基质硬度背景大鼠肝癌模型肿瘤生长、恶性程度(侵袭转移)均明显高于低肝基质硬度背景大鼠肝癌。生长于高基底硬度表面的肝癌细胞侵袭转移关联基因表达均明显增强,提示胞外基质硬度参与肝癌侵袭转移的调控。第二部分胞外基质硬度上调肝癌细胞VEGF蛋白表达及其分子调控机制目的研究胞外基质硬度改变对肝癌细胞VEGF蛋白表达的调节及其相关分子机制。方法检测不同肝基质硬度背景Buffalo大鼠肝癌组织芯片中VEGF, CD31, COL1,LOX蛋白表达情况,并对其相关性进行分析；对生长于不同基底硬度表面两种肝癌细胞的VEGF表达,整合素亚型表达及PI3K-AKT信号通路变化进行检测分析,用特异性抗体封闭肝癌细胞表面整合素验证硬度信号改变胞内信号传递通路的特异性。结果对组织芯片免疫组化结果分析显示,随着胞外基质硬度增加,VEGF,CD31,COL1,LOX的表达均明显增加,且VEGF与COL1 (r=0.533)及LOX(r=0.517)表达均呈正相关；生长在不同基底硬度细胞平台的两种肝癌细胞,其VEGF,p-PI3K, p-AKT的表达水平均随基底硬度增加而表达水平升高,同时两种肝癌细胞整合素亚型α 5,β 1增强最明显。利用单克隆抗体封闭癌细胞表面integrin β1,实验组VEGF, p-PI3K, p-AKT的表达水平较对应时间点的对照细胞明显降低。结论胞外基质硬度增加可通过激活整合素β1-PI3K-AKT信号途径上调肝癌细胞VEGF蛋白表达,进而促进血管新生。第三部分胞外基质硬度参与肝癌细胞EMT调控及其分子机制目的研究胞外基质硬度改变对肝癌细胞EMT的调节及其相关分子机制。方法对在不同基底硬度细胞培养平台生长的肝癌细胞MHCC97H、Hep3B的EMT相关蛋白分子进行检测,然后用TGF-β1分别干预肝癌细胞,进一步检测干预前后、及干预后不同时间点肝癌细胞EMT相关分子蛋白表达的改变情况及信号分子smad2/3磷酸化水平的变化情况；同时检测分析不同基质蛋白包被的不同基底细胞培养平台对肝癌细胞形态及snail基因有否显著影响。结果随着基底硬度的增加,生长于其表面的两种肝癌细胞,其上皮化标志分子E-cadherin, β-catenin表达均明显降低, 而间质化标志分子N-cadherin, vimentin,α-SMA表达水平则明显升高,提示肝癌细胞发生EMT转化。用TGF-β1干预刺激肝癌细胞,两种细胞上述EMT相关蛋白分子与未干预对照肝癌细胞相比,变化趋势更加显著,且随着基底硬度增加及TGF-β1刺激时间延长肝癌细胞信号分子smad2/3活化水平明显升高。不同基质蛋白包被的细胞培养平台生长的肝癌细胞,随基底硬度增加细胞形态及snail变化基本一致,提示该体系肝癌细胞EMT发生主要来自于硬度改变,与不同基质蛋白类型的包被无明显相关。结论胞外基质硬度增加可通过smad2/3信号途径独立诱导肝癌细胞EMT发生。创新点1.建立了可用于基质硬度影响肝癌研究的体内实验动物模型和体外实验技术平台即不同肝基质硬度背景大鼠肝癌模型及不同基底硬度细胞培养平台。2.明确胞外基质硬度可参与肝癌侵袭转移的调控,发现基质硬度增加可独立诱导肝癌细胞EMT发生及上调肝癌细胞VEGF蛋白表达分子机制。潜在应用价值1、提供接近临床的伴肝硬化背景肝癌状况的实验数据,并利用肝癌基质硬度这一物理力学参数,指导临床肝癌诊疗,预后评估。2、为深入研究胞外基质硬度变化影响肝癌细胞生物学行为及其参与肝癌侵袭转移的调控提供实验基础。