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目的1、建立小鼠过敏性哮喘模型,观察哮喘小鼠气道炎症、气道重塑和气道反应性变化,探讨小鼠哮喘上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)分子学调控机制。2、观察经IKKβ酶抑制剂BMS-345541、溴化结构域蛋白抑制剂JQ1干预对哮喘小鼠气道炎症、气道重塑及EMT的影响,为更好的防治哮喘气道重塑提供新的理论研究依据。方法1、小鼠随机分成卵清蛋白(ovalbumin,OVA)诱导哮喘组(OVA组)、正常对照组(对照组),每组8只,OVA组利用OVA加氢氧化铝(AL(OH)3)凝胶间隔7天连续致敏三次后再每日5%OVA雾化激发7天,建立小鼠哮喘模型。对照组在同样的周期内用磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffered solution,PBS)替代OVA进行致敏和激发。观察指标:(1)小鼠雾化激发时的行为观察;(2)通过动物肺功能仪采用整体体积描记法测定肺阻力(Lung resistance,RL),观察雾化吸入递增浓度乙酰胆碱(acetylcholine chloride,Ach)后小鼠RL的变化;(3)计算肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid,BALF)细胞总数与嗜酸性粒细胞百分比;(4)酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assays,ELISA)实验测定血清及BALF中转化生长因子β1(transforming growth factorβ,TGFβ1)的浓度;(5)肺组织切片行苏木精-伊红(haematoxylin and eosin,HE)染色、过碘酸雪夫(periodic acid-schiff,PAS)染色及改良Weigert间苯二酚复红染色法观察小鼠肺组织形态学改变;(6)实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测哮喘小鼠EMT相关钙粘蛋白(E-Cadherin)及波形蛋白(vimentin)基因信使核糖核酸(messenger RNA,mRNA)表达水平;(7)western blot检测E-Cadherin及vimentin蛋白表达水平。2、在成功建立小鼠哮喘模型的基础上将小鼠随机分成OVA组、BMS-345541干预组(BMS+OVA组),同时设立正常对照组及二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)干预对照组(DMSO+OVA组),每组8只,其中BMS+OVA组小鼠于每次5%OVA雾化激发前将BMS-345541溶液(50μg/g)经胃管注入OVA哮喘小鼠连续进行干预7天,干预对照组(DMSO+OVA组)同样予喂食针注入同等剂量的DMSO溶液。观察指标:(1)各组小鼠雾化激发时的行为观察;(2)RL值测定;(3)计算BALF中细胞总数与多种细胞分类(巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、淋巴细胞等)的百分比;(4)ELISA测定血清及BALF中TGFβ1浓度;(5)HE、PAS染色及改良Weigert间苯二酚复红染色观察肺组织形态学改变;(6)测定气管管壁上皮厚度;(7)免疫组化染色观察哮喘小鼠E-Cadherin及vimentin表达,测定其阳性表达单位面积累积光密度值(integrated option density,IOD);(8)RT-qPCR检测E-Cadherin及vimentin基因mRNA表达水平;(9)western blot检测E-Cadherin及vimentin蛋白表达水平。3、将24只小鼠随机分成OVA组、JQ1干预组(JQ1+OVA组)及正常对照组(对照组),每组8只,成功建立OVA小鼠哮喘模型,在OVA哮喘模型基础上JQ1+OVA组小鼠于每次5%OVA雾化激发前经腹腔注入JQ1溶液(50μg/g)进行干预,连续7天。观察指标:(1)各组小鼠雾化激发时的行为观察;(2)BALF中细胞总数与嗜酸性粒细胞百分比变化;(3)HE、PAS及改良Weigert间苯二酚复红染色观察肺组织形态学变化;(4)RT-qPCR检测E-Cadherin及vimentin基因mRNA表达水平;(5)western blot检测E-Cadherin及vimentin蛋白表达水平。结果1.第一部分实验结果(1)行为表现:OVA致敏哮喘小鼠经雾化激发后较正常对照小鼠明显出现烦躁不安、活动减少、呼吸困难、大小便失禁等哮喘发作表现。(2)肺组织病理染色形态学改变:OVA致敏激发哮喘小鼠肺内可见大量炎性细胞浸润,气道壁增厚、破坏明显,气管痉挛,管腔变狭窄,杯状细胞增生,粘液腺分泌增加,粘液栓形成,弹力纤维增生。(3)RL测定结果:OVA组小鼠RL值随Ach吸入浓度的增加而逐渐升高,与正常对照组小鼠比较差异显著(P﹤0.01)。(4)BALF细胞总数及嗜酸性粒细胞百分比:与对照组比较,OVA组小鼠BALF细胞总数及细胞分类中嗜酸性粒细胞百分比均明显增多(P﹤0.01)。(5)血清及BALF中TGFβ1浓度测定:OVA组小鼠血清及BALF的TGFβ1浓度均较对照组升高(P﹤0.01)。(6)E-Cadherin及vimentin的mRNA基因水平及蛋白水平表达:OVA组E-Cadherin基因及蛋白表达降低,而vimentin基因及蛋白表达升高(P﹤0.05),各组小鼠基因表达与蛋白表达水平相一致。2.BMS-345541干预后结果(1)经BMS-345541干预后哮喘小鼠在OVA激发时哮喘样发作及呼吸困难的症状缓解、减轻。(2)肺组织病理染色可见炎性细胞浸润减少,粘液腺分泌减轻,杯状细胞增生减少,弹力纤维增生减轻。(3)BMS+OVA小鼠RL值较OVA组降低明显(P﹤0.01)。(4)BMS+OVA小鼠BALF细胞总数及嗜酸性粒细胞百分比降低(P﹤0.05)。(5)BMS+OVA小鼠气管管壁上皮厚度减少(P﹤0.001)。(6)BMS+OVA小鼠血清及BALF中TGFβ1浓度(42.04±28.38 pg/ml,25.45±14.15 pg/ml),与OVA组(84.41±38.18 pg/ml,44.36±10.98pg/ml)比较有明显降低(P﹤0.05)。(7)BMS+OVA组小鼠肺组织E-Cadherin免疫组化阳性表达单位面积IOD值0.22±0.07,vimentin的IOD值0.17±0.04,与OVA组比较BMS+OVA组E-Cadherin表达增强,而vimentin表达减弱(P﹤0.05)。(8)OVA+BMS组小鼠E-Cadherin基因mRNA及蛋白表达水平上调,vimentin基因mRNA及蛋白表达水平下调(P﹤0.05)。(9)BMS+OVA组与正常对照组比较差异无统计学意义(P﹥0.05)。3.JQ1干预后结果(1)哮喘小鼠经JQ1干预后哮喘发作症状缓解。(2)与OVA组比较,JQ1+OVA组小鼠气道炎性细胞浸润减少,气管壁破坏、气道痉挛减轻,粘液渗出及杯状细胞增生减少,弹力纤维增生减轻。(3)JQ1+OVA组小鼠BALF中细胞总数及嗜酸性粒细胞百分比减少(P﹤0.01)。(4)JQ1+OVA组小鼠E-Cadherin mRNA及蛋白表达明显增强,vimentin mRNA及蛋白表达明显减弱(P﹤0.01),各组小鼠基因表达与蛋白表达水平相一致。(5)JQ1+OVA组与对照组比较差异无统计学意义(P﹥0.05)。结论1、OVA致敏和激发可以成功诱导小鼠过敏性哮喘模型的建立。2、OVA哮喘小鼠存在明显气道炎症、气道高反应性及气道重塑。3、OVA哮喘小鼠TGFβ1分泌增加,TGFβ1可能与哮喘EMT相关。4、OVA哮喘小鼠气道重塑存在EMT,细胞粘附分子E-cadherin表达减少,细胞骨架蛋白vimentin表达增多可导致EMT的发生。5、IKKβ酶抑制剂BMS-345541和溴化结构域蛋白抑制剂JQ1均可明显降低哮喘小鼠气道炎症,抑制EMT,减轻气道重塑。6、气道重塑EMT与TGFβ1、NF-κB、BRD4的分子调控有关,NF-κB/RelA-BRD4信号通路调控将为哮喘未来的治疗提供新的靶向。