研究背景膀胱癌是泌尿系统最常见的肿瘤,世界范围内,膀胱癌发病率居恶性肿瘤的第九位[1]。以顺铂(cis-Dichlorodiamineplatinum, CDDP)为基础的联合化疗在晚期膀胱癌的治疗中占有重要地位,目前一线的化疗方案包括GC(吉西他滨+顺铂)、MAVC(甲氨蝶呤+阿霉素+长春新碱+顺铂)[2]。化疗能够一定程度上延长晚期膀胱癌患者的生存期,但是其总体预后依然很差[3],其中一个重要的原因是对顺铂耐药。因此,增强膀胱癌细胞对顺铂的敏感性、逆转耐药是一种值得期待的治疗策略,对晚期膀胱癌治疗有重大的临床意义。顺铂的主要抗肿瘤机制是造成肿瘤细胞DNA损伤,它能引发肿瘤细胞的DNA损伤反应(DNA damage response, DDR) [4]。适量的DNA损伤可以被识别并通过多种修复途径得以修复,相反,若DNA损伤无法得到有效的修复,细胞将会导致凋亡[5-8]。DDR包括细胞周期检测点通路激活、DNA修复、凋亡等过程协调进行。细胞周期检测点的激活对维持基因组稳定、细胞生存尤为重要,因为它的激活可以阻滞细胞周期进程,为DNA的修复提供时间[9]。ATR (Ataxia Telangiectasia and Rad3-related Protein, ATR)是DNA损伤反应中的一个关键激酶和信号转导蛋白。主要有两种功能,第一,DNA损伤可激活ATR蛋白,使ATR与DNA损伤位点结合,进一步磷酸化并激活检测点激酶1(checkpoint kinase 1, Chkl),激活检测点通路最终导致周期阻滞为DNA修复争取时间[10]；第二,ATR能够磷酸化DNA修复相关蛋白,直接调节DNA的修复过程[11]。DNA损伤后,ATR结合于DNA的损伤位点并磷酸化Chkl,pChk1又继续磷酸化Cdc25蛋白,Cdc25是一种磷酸酶,磷酸化的Cdc25 (pCdc25)是一种失活的状态,因而不能去除细胞周期蛋白依赖激酶(Cyclin dependent kinase. CDK)的抑制性磷酸化,导致细胞周期不能向下进展,从而有时间修复DNA损伤、并且避免了受损的DNA遗传信息传至子代细胞[5,11]。顺铂等DNA损伤药物可以激活ATR通路,激发细胞的DNA修复,DNA修复的异常调节与化疗抵抗密切相关[12,13]。因此,抑制ATR-Chk1通路可能成为一种增强DNA损伤化疗药物效能的重要策略[10]。正常细胞有完整的G1期和S/G2M的检测点通路保证基因组稳定,而肿瘤细胞常常缺少G1期检测点通路[14-20]。ATM和ATR是DNA损伤反应中两个主要的信号传导者,ATR主要负责S/G2M期的检测点通路激活,而ATM可激活G1检测点通路[10,21]。肿瘤细胞通常由于ATM/p53通路缺陷,主要依靠ATR相关的S/G2M的检测点通路激活导致周期阻滞而进行DNA修复[22-27]。因此,正常细胞由于有完整的G1、S/G2M的检测点通路,抑制ATR-Chk1检测点通路后,可以通过G1期检测点通路完成DNA修复,而肿瘤细胞G1期检测点通路功能缺陷,更加依赖S/G2M期ATR通路的激活以修复DNA损伤,ATR-Chk1通路抑制后能够特异性的增强肿瘤细胞对DNA损伤药物的效果[28-30]。Cdc6 (Cell division cycle 6)是重要的复制起始蛋白,在G1期,Cdc6可以组装前复制复合体(pre-replicative complexes, pre-RC)于复制起始位点,启动DNA复制[31]。一旦复制启动,Cdc6就被转运至细胞质。但是研究发现,DNA复制启动后依然有相当一部分Cdc6停留于细胞核,这说明Cdc6除了组装pre-RC蛋白以启动DNA复制外还有其他重要功能[32]。最近研究发现,Cdc6与ATR通路的激活有关,Cdc6能与ATR发生物理性的相互作用,在DNA损伤环境下,Cdc6对ATR相关的检测点通路激活有重要作用[33]。在酵母菌中,Cdc6定位于染色Rad3-Rad26复合体(与哺乳动物细胞ATR-ATRIP同源)的受体签,清除Cdc6蛋白会抑制Rad3(与ATR同源)和Rad26(与ATRIP)与梁色质的结合[34]。此外,Cdc6与多种肿瘤发展预后密切相关[35-40]。Cdc6在膀胱癌组织中的表达如何,Cdc6对于膀胱癌的肿瘤特性有何影响、Cdc6与ATR检测点通路与顺铂抵抗间的关系尚未见报道。去甲斑蟊素(Norcantharidin, NCTD)是斑蟊素去掉甲基的产物,斑蟊素是从中药斑蝥中提取的抗肿瘤成分,当它去掉甲基后保留了原有的抗肿瘤活性,而且减少了对泌尿系统和消化系统的副作用[41,42]。研究发现NCTD可以使多种肿瘤中Cdc6表达下降[43-45]。那么NCTD对膀胱癌细胞尤其是耐药的膀胱癌细胞中Cdc6的表达是否有同样的抑制作用呢?NCTD是否能够通过抑制Cdc6,从而抑制ATR-Chkl通路,导致DNA修复能力减弱而增强顺铂抗肿瘤作用、逆转顺铂耐药呢?研究目的、方法和结果第一部分：Cdc6在膀胱癌组织、膀胱癌细胞系表达特征实验目的和方法：为探索Cdc6在膀胱癌中的表达及与膀胱癌临床病理特征的关系我们进行了这部分试验：1.Western blot检测膀胱癌临床标本中癌组织和癌旁组织Cdc6的表达；2.组织芯片免疫组化染色,探索Cdc6与膀胱癌临床病理结果的关系；3.检测膀胱癌细胞系中Cdc6的表达。实验结果：第一,Western blot结果提示所有12例膀胱尿路上皮癌病人癌组织的Cdc6表达都显著的高于相应的癌旁边组织(P<0.05)；第二,组织芯片免疫组化结果提示,115例癌组织中有81例患者Cdc6为阳性高表达(70.43%),在50例癌旁边组织中仅有3例Cdc6为阳性高表达(6%),癌组织的高表达性率显著高于癌旁组织(P=0.000)；在44例高级别尿路上皮癌组织中,有37例为Cdc6阳性高表达(阳性率:84.09%),在71例低级别尿路上皮癌组织中,有44例为阳性表达(阳性率：61.97%),两者有统计堂羞显；第三,在82例肌层浸润性性尿路上皮癌中,有62例为Cdc6阳性(阳性率：75.61%),而33例非肌层侵润性膀胱尿路上皮癌中,有19例为Cdc6阳性(阳性率：57.56%),但是两者比较无显著性差异；第四,Cdc6的阳性率在不同年龄组及性别间无显著性差异。此外我们还检测了T24、UMUC3、5637膀胱癌细胞系的Cdc6表达,发现Cdc6普遍表达于膀胱癌细胞,其中UMUC3细胞系Cdc6表达最高,T24次之,5637细胞最少。第二部分：Cdc6沉默对膀胱癌的肿瘤特性影响目的和方法：研究表明Cdc6对DNA复制的起始至关重要,我们的研究表明Cdc6在膀胱癌组织中高表达且与病理分级相关。这探索Cdc6对膀胱癌细胞的增殖、迁移、侵袭的影响,我们选取UMUC3及T24细胞作为研究对象,以siRNA作为干预手段,通过Brdu掺入实验、划痕实验、Transwell迁移、侵袭实验,探索下调Cdc6的表达对膀胱癌细胞DNA复制、迁移、侵袭的影响。研究结果：Si-Cdc6降低Cdc6表达,UMUC3、T24细胞的Brdu阳性率(DNA复制标志)明显减少,划痕实验及Transwell迁移、侵袭实验都表明抑制Cdc6的表达能够明显地延长划痕愈合时间,显著减少穿过Transwell室的细胞数目。第三部分：筛选耐药膀胱癌细胞并比较非耐药细胞与耐药细胞Cdc6及ATR表达实验目的和方法：为研究膀胱癌耐药机制,我们首先要获得耐药的膀胱癌细胞。我们利用顺铂长期间断作用的方式来筛选耐药的膀胱癌细胞,并通过MTS细胞增殖活力实验证实,筛选出的UMUC3R细胞对顺铂的耐受力是否更强。顺铂作主要的作用机制在于导致肿瘤细胞DNA的损伤,从而诱导肿瘤细胞的凋亡。那么我们推测,膀胱癌细胞对顺铂的耐药可能是由于耐药细胞对顺铂造成的DNA损伤有更为强大的修复功能。鉴于ATR在DNA损伤反应中的关键作用以及Cdc6与ATR的密切关系,我们推测,耐药的膀胱癌细胞中高表达的Cdc6能够促进ATR与DNA损伤位点结合,更有效地激活检测点通路,使其细胞DNA修复增强。通过Chromatin binding实验分离与染色质结合和非结合的蛋白,检测UMUC3和UMUC3R细胞中ATR和Cdc6在染色质结合与非结合部分的表达。实验结果：第一,MTS细胞增殖活力实验证实,在相同的顺铂浓度和作用时间下,通过顺铂筛选后的UMUC3R细胞的细胞活动明显强于UMUC3细胞,随着顺铂作用的时间和浓度增加对顺铂的耐药性表现更为突出。第二,ATR的Chromatin binding实验结果提示,在顺铂浓度为0μg/mL时,相对耐药的UMUC3R鱼chromatin binding ATR的表达量更高,这意味着耐药的UMUC3R细胞中的ATR处于一个相对激活的状态。第三,在顺铂导致DNA损伤后,两种细胞的ATR表达都升高,但是耐药的UMUC3R细胞在受顺铂刺激后,chromatin binding ATR对于UMUC3细胞表达量更多,这提示UMUC3R细胞有更多的ATR进入细胞核,以启动ATR的检测点通路来修复受损的DNA。第四,Cdc6的Chromatin binding实验结果提示,当顺铂作用膀胱癌肿瘤细胞后,DNA的复制受到抑制,所以Cdc6的表达下降,在相同尝试顺铂作用后,相对耐药的UMUC3R细胞中Chromatin binding Cdc6的表达量高于未经顺铂筛选的UMUC3细胞；第五,UMUC3R细胞在不同浓度的顺铂作用后,随着顺铂浓度的加大,chromatin binding Cdc6并没有明显减少,这说明顺铂耐药的UMUC3R,在DNA受损后,与染色质结合的Chromatin binding Cdc6更加稳定,相对于UMUC3细胞,chromatin binding Cdc6表达增高。鉴于Cdc6与ATR的密切关系,UMUC3R细胞顺铂耐药的机制可能是其DNA损伤时Chromatin binding Cdc6加稳定,促进ATR邀活入核结合于DNA损伤部位,更有效地启动检测点通DNA修复。第四部分：探索抑制Cdc6表达是否增强顺铂对相对耐药的UMUC3R和非耐药的UMUC3细胞的凋亡诱导作用实验目的和方法：第一,为检测抑制Cdc6(Si-Cdc6)是否能够增强顺铂(CDDP)对膀胱癌细胞的凋亡诱导作用、逆转膀胱癌耐药,我们选取耐药的UMUC3R和非耐药的UMUC3细胞,分为Si-Cdc6+CDDP组、CDDP组、Si-Cdc6组、Si-negative control组,用Annixin V-PI双染法行凋亡染色并流式检测凋亡率。研究结果：第一,在4ug/ml的顺铂作用后,UMUC3R细胞的凋亡率平均为9.2%,明显低于UMUC3细胞(21%),P<0.05,再次证明UMUC3R细胞对顺铂的耐药性;第二,UMUC3R细胞Si-Cdc6+CDDP联合作用组凋亡率(21.5%)明显高于CDDP单独作用组(9.2%),UMUC3细胞的Si-Cdc6+CDDP联合作用组凋亡率(37.7%)明显高于CDDP单独作用组(21%),P值均<0.05第三,Si-Cdc6干扰能够诱导UMUC3R和UMUC3细胞少量的凋亡,凋亡率分别是(4.9%,5.0%)。两种细胞联合腹胀组的凋亡率都明显大于Si-Cdc6或者顺铂单独作用。这说明,Cdc6干扰后能增强膀胱癌细胞对顺铂的敏感性。第五部分:探索抑制Cdc6逆转膀胱癌顺铂耐药的机制实验目的和方法：ATR是细胞受到DNA损伤启动DNA修复的重要蛋白,研究认为,Cdc6能够与ATR相作用,促进ATR与DNA受损部位结合,因此我们推测,Cdc6干扰逆转UMUC3R细胞耐药的机制可能是抑制Cdc6导致后续的ATR-Chkl-Cdc25检测点通路失活,不能引起DNA修复必需的周期阻滞,最终细胞在存在DNA损伤情况下进入下一细胞周期造成异常有丝分裂。为检测干扰Cdc6表达对UMUC3R细胞的ATR-Chkl-Cdc25C通路影响,我们通过Chromatin binding和Western blot检测了Cdc6干扰后,与染色质结合的ATR、磷酸化Chk1和Cdc25的表达;通过PI染色流式周期测试,检测细胞是否突破检测点通路的周期阻滞；通过pH3(有丝分裂标志)和γ-H2AX(DNA损伤标志)的免疫荧光染色,观测干扰Cdc6后是否出现未完成DNA修复而异常进入有丝分裂肿瘤细胞。研究结果：第一,顺铂能够激活ATR-Chk1-Cdc25C通路,下调Cdc6蛋白的表达后,Chromatin binding ATR达下降,下游Chk1、Cdc25C的磷酸化也相应下降,这意味Si-Cdc6抑制了整条ATR通路的激活；第二,细胞周期分析显示,SiRNA下调Cdc6表达后,导致G1期细胞增多,S期数目减少,Cdc6干扰后,Cdc6的表达下降,削弱了Cdc6组装为前复制复合体的功能,导致DNA复制启动受到抑制,从而细胞阻滞在G1期；第三,顺铂导致DNA损伤,形成S期阻滞,Cdc6沉默能够突破顺铂导致的S期阻滞,使细胞异常地进入到G2/M期,G2M期细胞增多。pH3(有丝分裂标志)及γ-H2AX(DNA损伤标志)免疫荧光检测发现,顺铂导致有丝分裂期细胞(pH3+)减少,并导致了一定比例的DNA损伤(γ-H2AX+,29%),当Si-Cdc和CDDP联合作用时,UMUC3R细胞的DNA损伤加重(-H2AX+细胞增多,48.8%),而且出现了DNA损伤未完成修复而异常进入有丝分裂期的细胞(pH3+-γ-H2AX+双阳性细胞,7.6%)。说明干扰Cdc6表达后,细胞没有有效的完成DNA修复,并且突破ATR检测点激活导致的周期阻滞,导致细胞带着DNA损伤异常进入有丝分裂期。第六部分：通过顺铂抵抗膀胱癌裸鼠移植瘤模型,探索在体内通过去甲斑螯素(NCTD)抑制Cdc6是否能够逆转耐药目的和方法：第一,首先我们探索了NCTD是否能够抑制膀胱癌细胞的Cdc6表达,利用Western blot检测NCTD作用后Cdc6表达,证实NCTD对膀胱Cdc6的抑制作用；第二,为检测在体内抑制Cdc6表达是否能通过抑制ATR通路,从而增强顺铂(CDDP)抗肿瘤作用,我们用相对耐药的UMUC3R膀胱癌细胞构建了裸鼠皮下移植瘤模型,成瘤后分为NCTD+CDDP联合组,NCTD组、CDDP组、空白对照(Ctr1)组4组,按组行药物腹腔注射,观察肿瘤生长速度,并对肿瘤组织进行免疫组化分析,检测Cdc6、ATR、γ-H2AX表达,以反映Cdc6的抑制情况、ATR通路的激活情况及DNA损伤情况。研究结果：第一,Western blot结果证实去甲斑蟊素(NCTD)能够抑制UMUC3R和UMUC3细胞中Cdc6的表达；第二,动物实验结果显示,顺铂或去甲斑蟊素单独作用组,耐药膀胱癌移植瘤生长速度相对于空白对照组减慢,但肿瘤依然逐渐增大,这说明顺铂或去甲斑蝥素对耐药的UMUC3R移植瘤生长有一定的延缓作用,但是不能缩小肿瘤,单独运用顺铂并不能起到有效的杀伤肿瘤作用；第三,顺铂+去甲斑蟊素联合运用对肿瘤生长抑制作用最强,而且在第15天时肿瘤的体积有明显的减小趋势,这说明耐药的UMUC3R移植瘤受到了有效的杀伤；第四,小鼠肿瘤免疫组化结果提示,去甲斑蝥组的Cdc6表达明显低于空白对照组,这说明接受去甲斑蟊素治疗的肿瘤内Cdc6的表达受到了抑制。在去甲斑蝥素+顺铂联合组,Cdc6的表达最弱,ATR的表达明显弱于顺铂组,γ-H2AX的表达比顺铂单独作用明显增多,这说明联合组的ATR检测点通路受到抑制,从而无法造成周期阻滞为DNA修复提供时间,也难以启动DNA修复,最终造成大量的DNA损伤(γ-H2AX高表达)。去甲斑蝥素能够抑制Cdc6表达,导致ATR检测点通路激活受抑制,从而提高顺铂对肿瘤细胞的DNA损伤能力,抑制肿瘤生长,逆转顺铂耐药。研究结论综上所述,Cdc6在膀胱癌组织中高表达,并且与膀胱癌的病理分级相关。抑制Cdc6可以抑制膀胱癌肿瘤细胞的DNA复制、迁移和侵袭,通过顺铂长期间断作用筛选出相对耐药的UMUC3R细胞,发现在顺铂作用下,UMUC3R中染色质结合的Chromatin binding Cdc6表达相对于非耐药的UMUC3细胞更高且更加稳定,且能激活更多的ATR与染色质结合。抑制Cdc6表达可以抑制ATR-Chkl检测点通路活性,使细胞突破检测点通路的周期阻滞,肿瘤细胞在DNA未完全修复情况下进入到有丝分裂期,从而增强顺铂的凋亡诱导作用,逆转UMUC3R细胞对顺铂的抵抗。动物实验通过去甲斑蟊素抑制Cdc6表达,也可以增强顺铂对肿瘤的杀伤,逆转对顺铂耐药,免疫组化也证实NCTD+CDDP联合,抑制了Cdc6表达,从而ATR通路的激活受到抑制,最终增强了DNA损伤(y-H2AX表达升高)。正常细胞有完整的G1期和S/G2M的检测点通路保证基因组稳定,而肿瘤细胞常常缺少的G1期检测点通路[14-20]。ATR主要负责S/G2M期的检测点通路激活,而ATM可激活G1检测点通路[10,21]。肿瘤细胞更加依赖S/G2M期发挥作用的ATR相关的的检测蹼通路,以形成周期阻滞并调节进行DNA修复[22-27]。因此,正常细胞由于有完整的G1、S/G2M的检测点通路,抑制ATR-Chk1检测点通路后,可以通过G1期检测点通路完成DNA修复,而肿瘤细胞G1期检测点通路功能缺陷,ATR-Chk1通路抑制后能够特异性的增强DNA损伤药物对肿瘤细胞的效果[28-30]。Cdc6在膀胱癌组织中高表达,在分化化良好的正常组织中表达较少。抑制Cdc6可以相对特异性的抑制肿瘤DNA复制、迁移、侵袭,Cdc6表达下调还可以抑制ATR-Chk1激活,特异性地增强顺铂对膀胱癌细胞的DNA损伤,而正常细胞DNA损伤,而正常细胞具有完整G1、S、G2M期检测点通路激活,对ATR检测点通路依赖性不强,从而不增加正常细胞的DNA损伤。因此,Cdc6可能成为相对特异的抗击膀胱癌、逆转膀胱癌顺铂抵抗的靶点。