降低肉鸡腹部脂沉积、提高肉品品质是家禽养殖业亟待解决的关键问题。关鍵性代谢中间体的结构类似物作为化学信号对代谢途径发生影响,从而定向地改变动物的生产性能。作为糖、脂代谢途径中重要的代谢中间体—柠檬酸的结构类似物,(-)-羟基柠檬酸[(-)-HCA]潜在的生物学功能在于调节机体糖代谢和脂代谢间的流向,但其对家禽营养物质代谢的影响则鲜有报道。因此,本研究在探讨肉鸡胚胎在不同发育阶段血清差异代谢物及肝脏蛋白质表达变化规律的基础之上,探讨胚胎导入(-)-羟基柠檬酸对家禽代谢变化的影响,尤其是其调控家禽脂代谢的影响及其生物化学机制。研究主要包括以下五个方面的内容:1基于代谢组学技术揭示肉鸡胚胎发育过程中血清代谢物变化肉鸡因天然具有高血糖和胰岛素抵抗等特点而被用于研究代谢异常、肥胖等疾病模型,但目前对于肉鸡胚胎发育期间血清代谢物的变化则未见详细的报道。因此,本试验选取180枚罗氏308肉鸡种蛋(65土0.2g),置于温度37±0.5℃℃,湿度65%条件下孵化,每30min90°翻转一次。孵化至14日龄(E14)、19日龄(E19)和出壳1日龄(H1)时,收集胚胎血清样本,并应用液相色谱-质谱和四级杆-飞行时间系统(LC/MS-QTOF)结合主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)以及变量投影重要性(VIP)确定差异变化的代谢产物。应用代谢物富集分析(MESA)法分析差异代谢产物涉及的主要代谢途径。试验结果表明,与E14日龄相比,5个核心血清代谢物(L-谷氨酰胺、L-苏氨酸、雌酮、果糖和硫辛酰胺)在E19日龄发生显著变化;与E19日龄相比,7个核心血清代谢物(L-谷氨酰胺、L-亮氛酸、L-异亮氨酸、一磷酸腺苷、一磷酸鸟苷、α-酮戊二酸和γ-氨基丁酸)在H1发生显著变化。E14日龄到E19日龄期间,胚胎通过升高L-谷氨酰胺和L-苏氨酸的含量促进蛋白质合成,通过升高雌酮含量促进性腺发育;该结果提示血清中谷氛酰胺、苏氨酸和雌酮含量的变化可作为评价肉鸡胚胎发育的候选指标;在胚胎发育后期,α-酮戊二酸起到促进三羧酸循环和胚胎生长的重要作用,而L-谷氨酰胺、L-异亮氨酸和L-亮氨酸含量显著下降,提示这三种氨基酸可作为早期雏鸡饲料添加剂满足其生长发育需求。2基于蛋白质组学技术分析肉鸡胚胎发育过程中肝脏蛋白表达的变化为探讨肉鸡胚胎发育不同阶段肝脏蛋白表达水平的变化,本试验选取180枚重量相近的罗氏308肉鸡种蛋,置于温度37±0.5℃℃,湿度65%条件下孵化,每30 min 90°翻转一次。孵化至E14、E19和H1时采集肝脏组织样本,应用相对和绝对定量的等量异位标签(iTRAQ)结合生物信息学分析技术筛选核心差异蛋白。结果显示,在E19和E14两个日龄之间共筛选出26个核心差异蛋白,主要促进脂肪酸降解(上调ACAA2、CPT1A 和 ACOX1)、内质网蛋白加工(上调 PDIs、CALR3、LMAN1 和 UBQLN1)和糖异生(上调 ALDH3A2、ALDH7A1、FBP1、FBP2、GPI 和 PGM2)。在 H1 和 E19两个日龄之间共筛选出15个核心差异蛋白,主要抑制或减弱糖酵解(下调AKR1A1、LDHA和LDHB;上调PGM2)和嘌呤代谢(上调NT5C),促进核糖体相关蛋白表达水平(RPL18A、RPL19、RPL7A、RPLP1、RPS2 和 RPS3A)。试验结果提示,糖酵解不是胚胎发育后期产生能量的主要方式,而ACAA2、CPT1A和ACOX1是调控胚胎期肉鸡脂代谢的关键因子。3(-)-羟基柠檬酸对胚胎期肉鸡肝脏脂肪代谢的影响为探讨(-)-HCA对肉鸡胚胎发育的安全性及脂滴沉积的影响,240枚罗氏308肉鸡种蛋被随机分为6组,并分别按照0、0.1、0.5、1.0、10.0和50 mg/kg(n=40)蛋重导入(-)-HCA,其溶解于50 μLDMSO溶剂,对照组导入50μL溶剂。置于温度37±0.5℃℃,湿度65%条件下孵化,每30 min 90°翻转一次。孵化至19日龄,采集血液及组织样品、待测。试验结果表明,(-)-HCA对不同发育期阶段鸡胚重量、肝脏绝对重量、脾脏绝对重量、心脏绝对重量和肾脏绝对重量等均无显著影响;血清中白蛋白、球蛋白、总蛋白、Cr、磷酸、AST、ALT和LDH含量均无显著变化,但0.1-50mg/kg(-)-HCA处理显著降低血清尿素氮含量(P<0.05);血液中红细胞和白细胞数量与对照组相比无显著变化。PAS和油红O染色结果显示,与对照组相比,1-50mg/kg(-)-HCA处理极显著增加糖原颗粒数量和减少肝脏脂滴数量(P<0.01);血清和肝脏脂代谢相关指标检测结果显示,1-50mg/kg(-)-HCA处理显著降低血清和肝脏中TG含量(P<0.05),显著增加肝脏NEFA含量以及肝脏HL和LPL活性(P<0.05),极显著增加肝糖原含量(P<0.01);0.5-50mg/kg(-)-HCA 处理显著降低血清 LDL-C 含量(P<0.05);0.5-1 mg/kg(-)-HCA处理显著增加血清葡萄糖含量(P<0.05);0.1-50 mg/kg(-)-HCA极显著增加血清ADP含量(P<0.01);不同浓度(-)-HCA处理对血清中TC、HDL-C、NEFA、T3、INS和GLU含量均无显著变化。0.5-10 mg/kg(-)-HCA处理显著降低ACLY、ME1和SREBP-1c mRNA相对表达水平(P<0.05),1-10 mg/kg(-)-HCA处理显著降低FAS mRNA相对表达水平(P<0.05),0.5-50 mg/kg(-)-HCA处理显著升高PPARαmRNA相对表达水平(P<0.05)。该研究结果提示,0.1-50mg/kg(-)-HCA处理对鸡胚发育是安全的;(-)-HCA减少脂滴沉积可能主要是通过降低脂肪酸合成基因ACLY、ME1和SREBP-1c和FAS mRNA的表达而抑制脂肪酸合成,从而降低甘油三酯的合成。4(-)-羟基柠檬酸调节胚胎期肉鸡血清差异代谢物及关键代谢途径分析试验选取360枚重量相近的罗氏308肉鸡种蛋随机分为两组,对照组导入50 μL DMSO,试验组导入含1 mg/kg蛋重(-)-HCA。置于温度37±0.5℃,湿度65%条件下孵化,每30 min 90°翻转一次。孵化至E19和H1时收集胚胎肝脏组织和血清样本,-8C℃保存备用。利用LC/MS-QTOF技术结合PCA和PLS-DA以及VIP分析确定差异变化的代谢产物。应用MESA法分析差异代谢产物涉及的主要代谢途径。试验结果表明,与对照组相比,(-)-HCA处理下在E19和H1日龄鉴定出的差异代谢产物主要分为4类:糖类、脂类、氨基酸和其他类别。对(-)-HCA处理组样品采用PCA模型进行主成分分析,发现(-)-HCA处理使得代谢模式图呈现规律变化,与对照组相比差异显著。在E19日龄,(-)-HCA可通过升高谷氨酰胺、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸和谷氨酸的含量促进蛋白质合成;通过升高苹果酸、柠檬酸、异柠檬酸和延胡索酸含量加速三羧酸循环;通过升高葡萄糖和果糖含量、降低乳糖含量加快糖异生进程;通过升高脂酰辅酶A的含量、降低花生四烯酸合成的重要脂质介质前列腺素含量促进脂肪分解,抑制或减少脂肪合成。在H1日龄,(-)-HCA可通过升高谷氨酰胺、苏氨酸、丙氨酸、亮氨酸和谷氨酸的含量促进蛋白质合成;通过升高苹果酸、柠檬酸、异柠檬酸和延胡索酸含量加速三羧酸循环;通过降低3-磷酸-D-甘油磷酸和乳酸含量抑制或减少糖酵解进程。试验结果提示在胚胎发育后期,(-)-HCA通过对代谢物的流向进行重分配促进蛋白质合成、糖原合成以及脂肪氧化利用,最终抑制或减少脂肪沉积。同时,促进胚胎生长发育、提高其应对环境变化能力。5(-)-羟基柠檬酸调控胚胎期肉鸡脂肪代谢主要效应蛋白的筛选和鉴定试验选取360枚重量相近的罗氏308肉鸡种蛋随机分为两组,对照组导入50μL DMSO,试验组导入含1 mg/kg蛋重(-)-HCA,其溶于DMSO溶剂中。置于温度37±0.5℃,湿度65%条件下孵化,每30min90°翻转一次。孵化至E14、E19和H1时收集胚胎肝脏组织样本,-80℃保存备用。利用基于iTRAQ的蛋白质组学的方法,筛选出(-)-HCA调节肉鸡胚胎期脂肪代谢关键代谢途径的效应蛋白因子。试验结果表明,与对照组相比,(-)-HCA处理后在E19日龄共筛选到8个核心差异蛋白,主要是促进脂肪分解(上调ACSL1、ACSL5、CPT1A和ACOX2表达水平),促进糖异生并抑制或降低糖酵解(上调FBP2、ALDH3A2和GPI,下调ALDOC);而在H1日龄共筛选到12个核心差异蛋白,主要是促进脂肪分解(上调CTP2、ACAT1、ALDH7A1、ECHSI、ECI2和ACAA2,下调ALDH9A1),抑制或降低糖酵解(上调ACSS1,下调PFKL和LDHB),加速柠檬酸循环(上调IDH1和ACO1)。试验结果提示在胚胎发育后期,(-)-HCA减少脂肪沉积的机制主要是通过调节脂肪代谢相关蛋白表达水平促进脂肪氧化利用。