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研究目的:应用单细胞转录组测序技术,在单个细胞水平上,研究人终末期红细胞随着分化的进行,基因表达的连续变化趋势;根据每个细胞的基因表达特征对其进行归类、分群;分析调控终末期红细胞分化与成熟的调控基因。研究方法:收集3例正常人骨髓,骨髓先经Ficoll密度梯度离心获得单核细胞悬液,再应用免疫吸附磁珠法分选出CD235a+细胞,即终末期红细胞,然后由10×genomics系统捕获单个细胞样本并构建测序文库,最后在illumina X ten平台上测序。测序数据经标准化,用CellRanger对细胞进行分群,通过各细胞群间表达的差异基因分析,筛选出各细胞群的特征性表达基因集。应用SuperCT机器学习的方法,根据已报导终末期红细胞基因表达数据,识别出每个细胞所处的分化时期。用Monocle重建细胞分化轨迹,并分析基因在整个分化过程中表达水平的变化特征。采用CellRouter方法识别出调控红系终末分化的调控基因,并挑选AKAP8L、TERF2IP和RF10三个在不同分化时期发挥作用的转录因子进行验证。研究结果:测序数据经过严格的标准化后,三例骨髓样本总共识别出8,668个有效细胞,约1.3×104个基因。CellRanger根据各细胞的基因表达特征,将细胞分成7个细胞群,除了7号细胞群,其它六个细胞群呈弧形连续的分布。将各个细胞群的细胞与SuperCT识别出的ProE、BasoE、PolyE和OrthoE细胞进行比对,发现68.7%的细胞处于OrthoE时期,只有1.3%细胞是ProE和5.0%细胞是BasoE。结合7个细胞群,我们发现(1)ProE、BasoE因细胞数较少且识别不出他们之后的差异性表达基因,故本研究不对其作过多分析;(2)PolyE细胞可以进一步分为三个不同的时期:分别命名为transit-PolyE、early-PolyE和late-PolyE;(3)OrthoE细胞也被进一步分成了两个不同的分化时期:early-OrthoE和late-OrthoE。此外,我们发现,随着红细胞的分化成熟,表达基因的数量在不断减少,而珠蛋白基因表达的总量占比在不断增加。我们还注意到一个有趣的现象:在mRNA水平上,几乎每个脐带血细胞内可同时高表达γ-和β-珠蛋白基因,而骨髓细胞内只高表达β-珠蛋白基因。用Monocle重建分化轨迹之后,随着终末红细胞分化轨迹的进行,我们根据基因表达的变化趋势不同归纳为三大类:第一类是在早期高表达,而后迅速表达下调的基因;第二类是在早期高表达并持续高表达到PolyE期才下调表达的基因;第三类是先升高表达,随后下调表达的基因。通过CellRouter分析,我们挖掘出了 253个参与调控终末期红细胞分化的调控因子,其中正调控因子(108个)和负调控因子(145个)。通过CD34+细胞体外红系诱导分化体系,分别在细胞中敲降AKAP8L、TERF2IP和RNF10基因,结果表明敲降后它们在不同的时期抑制红细胞的分化与成熟。结论:1.在传统终末期红细胞分期的基础上将PolyE细分为三个时期,将OrthoE细胞细分为两个时期,并阐明其基因表达特征及相关生物学功能。2.胎儿红细胞内可以同时大量表达γ-和β-珠蛋白基因mRNA。3.阐述了随着分化的进行,人体内(in vivo)终末期红细胞基因的连续表达谱。4.挖掘出在不同的时间点调节人终末红细胞分化的转录因子及其调控网络。