烟草雄性不育系在烟叶生产实践中广泛栽培,在杂交育种实践中也具有重要作用。烟草雄性不育为细胞质雄性不育(CMS,cytoplasmic male sterility),是由线粒体基因产物导致,核育性基因产物PPR蛋白(pentatricopeptide repeat)调控育性恢复。课题组前期开展栽培烟草雄性不育系Nicotiana tabacum L.cv.(gla.)S K326(Nta(gla.)S K326)和花烟草(Nicotiana alata)杂交育种研究,获得了该组合的杂交种,所得杂种分为两类,一类杂种个体育性恢复,而另一类杂种雄蕊发育,但花粉败育。推测父本细胞核中存在育性恢复基因,作用于母本线粒体不育基因产物,调控杂种的育性恢复。本研究以Nta(gla.)S K326、N.alata和两者的杂交后代为材料,同源克隆N.alata中的候选育性恢复基因,结合生物信息学分析、基因表达特征初步筛选育性恢复基因,将候选基因转化雄性不育母本,以探究Nta(gla.)S K326×N.alata杂种育性恢复机理,为烟草胞质雄性不育系及烟草野生种在杂交育种过程中的广泛运用奠定理论基础。主要研究结果如下:(1)利用同源克隆技术克隆获得27条父本花烟草花药中的ppr同源基因序列,根据基因的亚细胞定位、PPR蛋白三级结构和PPR基序特征,进一步筛选到18条候选育性恢复基因,再通过比对这些序列的相似性,最终获得10条可信度较高的候选育性恢复基因序列;(2)利用qRT-PCR检测上述得到的10条候选目的基因在转录水平的表达,检测其在父母本及育性不同杂种个体花药中的表达情况,结果表明上述基因的表达差异性符合育性恢复基因在育性不同烟草花药中的预测表达规律,进一步增加了上述序列为育性恢复基因的可能性;(3)将上述候选ppr基因分别连接到植物表达载体pBI 121上,构建重组质粒,利用农杆菌介导的方法转入雄性不育母本。对已获得的部分转基因植株进行转基因目的片段检测。结果表明:转基因植株中扩增出来的条带大小与质粒中的一致,且阴性对照没有扩增出任何条带。实验初步证明外源目的基因已整合到烟草基因组中,可以用于后期的表型鉴定及基因功能验证。其中,ppr582-2转化率为30%,ppr582-9转化率为20%,ppr581转化率为40%,ppr320转化率为62.5%。本研究克隆获得了花烟草中的多条ppr基因序列,结合生物信息学分析和基因的表达特征,初步筛选获得10条候选育性恢复基因,成功构建10条候选目的基因的过表达载体,并遗传转化雄性不育母本,后续将通过表型鉴定进一步验证上述序列的育性恢复功能。该研究为探究Nta(gla.)S K326×N.alata杂种育性的机制奠定了基础,为克隆和鉴定烟草中的育性恢复基因提供了思路。