球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是用于农林害虫生物防治的经典昆虫病原真菌,其生防潜能取决于常见侵染体分生孢子的产量、质量、对靶标害虫的毒力及抗逆力等诸多性状。这些生防潜能相关性状与若干细胞生物学事件密切相关,如孢子萌发、营养生长、孢子形成、多胁迫应答及寄主侵染等。真核生物的Ras小GTP酶大家族成员都可作为分子开关,调节细胞生长、分化、凋亡、基因转录、细胞骨架重组等系列细胞活动,但昆虫病原真菌的绝大多数成员尚无相关研究报道。本文通过构建和分析单基因敲除／回补菌株和正或负显性点突变菌株,研究解析球孢白僵菌Miro、Ras3和6个Rho小GTP酶调节或参与调节的生物学功能及其对球孢白僵菌生防潜能的贡献。主要结果摘要如下。球孢白僵菌小GTP酶Miro调控对胁迫耐受性和毒力至关重要的线粒体分布和流动性Miro同源蛋白是真核细胞中广泛存在的一类线粒体靶向的小G蛋白,属于Ras小GTP酶大家族,但在丝状真菌中的研究报道几近空白。球孢白僵菌中存在唯一的Miro同源蛋白bMiro,通过整体、截头或去尾的亚细胞定位研究,证明bMiro在线粒体外膜上的亚细胞定位完全依赖于其C末端45个氨基酸残基组成的跨膜结构域(TMD)。bMiro的功能缺失导致菌丝细胞中线粒体的聚集分布、总量减少及流动性降低,以致胞内ATP含量大幅下降,但并不致线粒体的形态发生变化。在限制性培养基上,敲除株Δbmiro对Ca2+、Mn2+、Zn2+和Mg2+的耐受力较野生株分别提高42%、37%、19%及10%。此外,敲除株的重要表型出现不同程度的缺陷,如孢子萌发缓慢,营养生长较弱,分生孢子耐高温、抗紫外辐射的能力及毒力下降,但对氧化和高渗胁迫无显著应答反应。所有表型变化都在回补株中恢复到野生株的水平。结果表明,球孢白僵菌bMiro调控的线粒体分布及运动是ATP释放能量运输金属离子所必须的,因而对球孢白僵菌的生防潜能具有显著贡献。新的Ras小GTP酶Ras3在Hogl信号通路上游发挥作用从而调控球孢白僵菌的产孢、多胁迫应答及毒力 真菌中关于Rasl和Ras2两个Ras小GTP酶协作或反向调节若干细胞事件的研究报道很多,罕见有第三个Ras蛋白存在的报道。本研究证明球孢白僵菌和许多其他丝状真菌中存在另一个Ras同源蛋白即Ras3。生物信息学结构预测分析显示,丝状真菌中的Ras3拥有Ras家族典型的5个结构域和两个GTP/GDP开关,只是Ras3蛋白C末端通常与膜定位相关的CAAX基序中半胱氨酸的位置从倒数第四位移至倒数第二位,但这一位移被证明并不影响其在球孢白僵菌细胞质膜上的定位。在球孢白僵菌中,ras3的缺失导致rasl在野生株中的转录水平随培养时间而显著改变,但对ras2的转录表达影响不大。与野生株相比,ras3敲除株在富营养培养基上的生长显著加快,但在一些不同碳氮源贫瘠培养基上菌落生长速率有所减慢。正常培养条件下,敲除株分生孢子产量显著降低,所产孢子耐高温、抗紫外能力及毒力显著下降。此外,敲除株对甲萘醌氧化胁迫的敏感性远高于对H202的氧化胁迫,对高渗胁迫的敏感性远高于胞壁干扰胁迫。敲除株对甲萘醌的高敏感性吻合超氧化物歧化酶基因转录水平及总酶活的显著下降,而高渗敏感性不仅吻合高渗甘油(HOG)信号通路中多数信号蛋白及关键转录因子Msn2的转录表达剧烈下调,而且吻合几乎检测不出的标志性激酶Hogl的表达及磷酸化信号。所有这些变化都因ras3的回补而修复。结果表明,Ras3在HOG信号通路上游扮演重要角色从而调节球孢白僵菌的产孢、多胁迫应答及毒力,因而是其适应众多昆虫寄主及复杂多样环境所必需的。球孢白僵菌Rho家族六个小G蛋白的功能解析球孢白僵菌Rho家族由六个小G蛋白组成,其中四个的编码基因(rho2、rho3、rho4及cdc42)分别被成功敲除和回补,而另两个的编码基因(rho1及racA)是敲除致死的,通过各自的正显性(DA)和负显性(DN)点突变而构建突变株DArho1、DNrho1、DAracA及DNracA。在这些敲除株和点突变株中,DNrho1、Δrho4及Δcdc42在富营养和不同碳氮源的贫瘠营养培养基上一致表现出或轻或重的生长缺陷。其中,DNrho1孢子萌发大幅延迟,菌丝增粗、隔膜增多,细胞变短；Δrho4菌丝常在隔膜处断裂成细管状无隔单细胞,以单一或分叉出芽的方式在其一端形成一或二个椭圆状细胞,显示其极性生长严重受阻,因而生长缺陷最严重。Δcdc42菌丝形态变化不大,但尖端细胞延长而使极性生长异常。DNrho1的产孢缺陷严重,Δcdc42次之。其余敲除株或点突变株没有明显的生长、产孢和萌发异常。在金属离子胁迫实验中,只有Cu2+的敏感性在Δrho2、 Δrho4、DArho1、DNrho1及DNracA中显著升高,而所有敲除株及点突变株对Mn2+、Ca2+、Fe2+、Mg2+、Zn2+等金属离子胁迫都表现为抗性增强或无显著反应。在化学胁迫实验中,只有Δrho4对氧化胁迫更加敏感,而其余敲除株及点突变株或更抗胞壁干扰及氧化胁迫,或对这些及高渗胁迫无显著反应。除Δrho2和Δrho3之外的敲除株及点突变株在菌落生长期间对高温热激变敏感,除Δrho4之外所有敲除株及点突变株的分生孢子对UV-B紫外辐射更敏感。在生物测定中,Δrho4的毒力严重受损,Arho2表现温和的毒力缺陷,而其余菌株表现同野生株。此外,回补株的所有表型与野生株无二。结果表明,Rho家族小G蛋白对球孢白僵菌的生物防治潜能具有不同程度和性质的贡献,Rho4主要贡献于毒力、抗氧化及耐高温能力,Rho1和Cdc42的主要贡献于产孢、孢子萌发及耐高温、抗紫外能力,Rho2和Rho3主要贡献于孢子萌发和抗紫外能力,RacA主要贡献于耐高温和抗紫外能力。