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CUL4B 是 Cullin 4B-Ring E3 泛素连接酶(Cullin 4B-Ring ubiquitin ligases,CRL4B)的骨架蛋白,CRL4B可以通过泛素化修饰调控多种重要底物蛋白,参与调控细胞周期、DNA损伤修复,信号传导等重要生理过程。我们前期研究表明,CUL4B还可以通过催化H2AK119单泛素化,招募多梳抑制复合物(Polycomb-repressive complex 2,PRC2),参与肿瘤抑制基因的转录调控。我们对CUL4B在不同实体肿瘤中的表达情况及相关分子机制进行了一系列研究,结果显示,CUL4B在肝细胞性肝癌高表达,通过激活Wnt/β-catenin信号通路促进肝细胞性肝癌的增殖和迁移;在胃癌组织中CUL4B可上调HER2表达促进胃癌细胞浸润和上皮间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT);在前列腺癌(prostate cancer,PCa)中,CUL4B 与 SOX4 形成正向调控反馈环路,促进前列腺癌细胞的增殖、EMT和转移;在胆管细胞癌中,CUL4B抑制抑癌基因P16和磷酸酶与张力蛋白同源物表达,促进肿瘤细胞增殖、迁移及EMT。CUL4B在恶性肿瘤发生发展中的作用及相关分子机制研究处于起步阶段,仍需进一步探索。C-MYC作为一种重要的转录因子,在前列腺上皮内瘤变(prostatic intraepithelial neoplasia,PIN)转化中发挥重要作用并参与维持前列腺癌干细胞特征,在肿瘤细胞的生存、增殖、转移和复发等各方面起着重要作用。研究表明,C-MYC促进雄激素受体(androgen receptor,AR)的转录,可作为去势抵抗性前列腺癌患者AR定向治疗的辅助治疗靶点。C-MYC蛋白水平因受到复杂的转录后及翻译后表观调控的影响,与其mRNA表达并不一致。在前列腺癌中关于C-MYC蛋白表达的表观遗传调控机制是目前研究热点之一。MicroRNAs(miRNAs)是一类由内源基因编码的非编码单链RNA分子,在胞质中miRNA可以通过碱基互补配对原则,引导Argonaute(AGO)蛋白与靶mRNA3’端非翻译区(3’-untranslated region,3’UTR)结合,介导基因沉默,属于转录后表观调控。研究显示,miRNAs在多种人类恶性肿瘤中表达失调,在恶性肿瘤细胞获取持续的增殖信号、逃避生长抑制、抗凋亡、促进永生化、诱导血管生成及促进浸润和转移等方面均发挥重要作用。鉴于C-MYC在前列腺癌发生发展中的关键作用,本研究探讨了在前列腺癌中CUL4B对C-MYC的调控作用,并从miRNAs的表观遗传学调控角度分析了其调控的相关分子机制。第一部分CUL4B在前列腺癌中高表达并与不良预后有关前列腺癌是美英等西方国家男性最常见的恶性肿瘤,在我国发病率呈持续上升趋势,且多数患者就诊时已是中晚期,是影响男性生命健康的常见肿瘤之一。我们前期研究显示,CUL4B在肝细胞性肝癌、胆管细胞癌、非小细胞肺癌、胃癌等多种实体肿瘤中高表达,在部分肿瘤中与临床病理参数具有关联性。CUL4B在前列腺癌中的表达及与预后的相关性研究方面目前取得以下成果:1.CUL4B在前列腺癌组织中表达上调并与Gleason评分相关:免疫组织化学染色方法显示,CUL4B在前列腺癌组织中的表达较良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia,BPH)组织明显上调(P<0.001),CUL4B 高表达与不同Gleason评分具有相关性(P=0.03)。2.公共生物信息数据库(TCGA/GEO)中的数据分析提示CUL4B的表达和不良临床预后相关:公共数据库(TCGA/GEO)分析结果显示,与癌周良性前列腺组织相比,CUL4B mRNA水平在前列腺癌组织中表达显著上调;在转移瘤中表达高于原发灶;CUL4B过表达与Gleason评分、病理分期、远处转移及生化复发相关。第二部分CUL4B转录后调控前列腺癌C-MYC蛋白水平本部分研究中,我们利用细胞实验及临床病例组织,在mRNA和蛋白水平上探讨了 CUL4B对C-MYC的调控关系,目前取得以下研究成果:1.CUL4B正向调控C-MYC蛋白表达:Western blot显示C-MYC蛋白在CUL4B siRNA敲减的PC3细胞中表达显著降低,在Flag4B质粒转染CUL4B过表达的22RV1细胞中显著上调。而在C-MYC mRNA siRNA干扰后,CUL4B蛋白表达并没有产生变化。这一结果提示CUL4B是C-MYC蛋白的正向调控因子,属单向调控。IHC显示,在前列腺癌组织中CUL4B与C-MYC蛋白表达水平高度相关(P=0.0014)。2.CUL4B表达异常不影响C-MYC mRNA表达:RT-qPCR检测显示,在PC3细胞CUL4B siRNA干扰后,或在22RV1细胞Flag4B过表达质粒转染后,C-MYC mRNA没有发生显著变化。提示在前列腺癌中CUL4B对C-MYC蛋白的正向调控属于转录后调节。第三部分CUL4B-miR-33b-5p-C-MYC轴促进前列腺癌的进展鉴于CUL4B对C-MYC的调控关系为转录后正向调控,我们推测CUL4B对C-MYC的调控可能通过miRNAs的介导作用实现。本部分研究对CUL4B促进前列腺癌的发生和进展相关分子机制提供了新的切入点。1.CUL4B转录抑制miR-33b的表达:我们提取PC3细胞CUL4B siRNA干扰后总RNAs,进行miRNA芯片分析,鉴定了 CUL4B调控的miRNAs谱系。接下来采用生物信息学技术,获取靶向C-MYC的miRNAs数据集,并与siCUL4B敲减后上调2倍及以上的miRNAs取交集。结果显示,miR-33b满足上述条件,且TCGA数据库大样本分析显示,miR-33b-5p在前列腺癌中表达较正常前列腺组织降低。因此,miR-33b-5p成为我们下一步实验的靶点。RT-qPCR检测表明,在PC3细胞siCUL4B干扰组pri-miR-33和miR-33b-5p表达水平均升高,在22RV1细胞CUL4B过表达质粒转染组pri-miR-33和miR-33b-5p表达水平均降低。ChIP检验表明CUL4B可结合到miR-33启动子区。上述结果提示,CUL4B在转录水平上抑制miR-33b表达。2.miR-33b-5p直接靶向C-MYC:双荧光素酶报告基因技术检测显示miR-33b-5p过表达显著抑制pmiR-GLO-C-MYC 3’UTR-Wt荧光素酶活性,而共转染 miR-33b-5 mimcs 和 pmiR-GLO-C-MYC 3’UTR-Mut 质粒,荧光素酶活性未见明显变化。Western blot检测表明,在PC3和22RV1细胞中过表达miR-33b可显著降低C-MYC的表达水平;而抑制miR-33b的表达,C-MYC表达水平上调。拯救实验显示,在22RV1细胞共转染Flag4B/Flagα及miR-33b mimics/NC后,miR-33b mimics部分抑制了 C-MYC的过表达,在PC3细胞中共转染 siCUL4B/siNC 及 miR-33b inhibitor/inhibitor NC 后,miR-33b inhibitor部分逆转了对C-MYC表达的抑制作用。3.miR-33b-5p抑制CUL4B诱导的前列腺癌细胞增殖:克隆试验、MTS实验及EdU实验表明,CUL4B可显著促进22RV1细胞的增殖能力,而共转染miR-33b-5p mimics/NC及Flag4B过表达质粒后,这一作用被部分抑制。4.miR-33b-5p抑制CUL4B诱导的前列腺癌细胞迁移浸润:划痕实验和transwell实验表明,CUL4B过表达可显著增强22RV1细胞迁移和侵袭能力,miR-33b-5p mimics可部分逆转CUL4B的上述作用。5.miR-33b-5p抑制CUL4B诱导的前列腺癌细胞干细胞相关分子表达:流式细胞仪分选实验统计结果表明,与阴性对照组比较,CUL4B过表达的22RV1细胞CD133+细胞数明显增多,而Flag4B+mimics组较阴性对照组比较降低了阳性细胞百分比。Western blot显示CUL4B过表达可上调CD133、CD44、Nanog、BMI蛋白的表达,而共转染miR-33b-5p mimics后,增强表达的效果明显减弱。综上所述,CUL4B在前列腺癌中高表达,可通过转录抑制miR-33b-5p正向调控C-MYC的表达,是促进前列腺癌增殖和进展的重要癌基因。miR-33b-5p可部分逆转CUL4B诱导的前列腺癌增殖、迁移浸润和干细胞相关分子标志物的表达。我们的研究阐述了 CUL4B促进前列腺癌发生和进展的相关分子机制,为前列腺癌的靶向治疗提供了新的潜在靶点和理论依据。