第一章:高致病性H7N9病毒的致病特征及生物特性研究背景:2017年,H7N9病毒发生变异,出现新型高致病性H7N9禽流感病毒感染病例。在广东高致病H7N9病人中,存在持续的病毒血症。为了进一步明确高致病性H7N9病毒的致病特点及生物特性,我们开展了以下研究。研究方法:收集患者临床资料,并采集高致病性H7N9病人的血浆和痰液进行病毒分离。采用液相芯片技术检测高致病性H7N9病人与正常人血浆的细胞因子水平。利用高致病性H7N9病毒和ZJU01毒株(2013年H7N9毒株)对小鼠进行病毒感染造模,观察两个毒株的致病特征。在感染后2天,4天,6天分别处理小鼠,取血清和器官组织,进行病毒检测和分离。利用高致病性H7N9病毒和ZJU01毒株感染A549细胞模型,提取外泌体,对外泌体中流感病毒及其基因进行检测。研究结果:高致病性H7N9病人存在病毒血症,血浆分离到活病毒。高致病H7N9病人同样存在细胞因子风暴,表现为 IL-1ra,IL-6,IP-10,IL-10,IFN-γ,MCP-3,IL-18,HGF,MCP-1异常高表达。动物实验中,高致病H7N9毒株的致病力明显强于ZJU01毒株,并导致模型小鼠病死。对高致病H7N9模型小鼠的组织器官进行病毒检测,发现多个重要脏器尤其是脑组织中检测和分离到高滴度的病毒。研究进一步证实,病毒感染的A549细胞分泌的外泌体含有病毒全基因组及具有感染性的病毒样颗粒。研究结论:高致病性H7N9病人持续存在病毒血症,诱导细胞因子风暴和重要组织器官的损害。脑部感染可能是病人致死的主要原因之一。外泌体包裹可能是病毒入血并导致肺外组织感染的重要途径之一。第二章:H7N9裂解佐剂(MF59)疫苗的长期稳定性和免疫原性研究研究背景:2013年至2018年,H7N9禽流感病毒在中国人群中造成了显著的发病率和病死率。H7N9疫苗对疾病预防至关重要。为验证MF59佐剂疫苗长期保存后是否保持稳定,我们评估了该疫苗的稳定性和免疫原性。研究方法:我们用疫苗株制备疫苗成品(抗原0.25 ml/剂量和MF59 0.25 ml/瓶)。在37±2℃环境中进行热稳定性测试,在第3、7、14、28天对血凝素含量进行检测。在25±2℃环境中进行加速稳定性试验,在第1、2、3个月进行血凝素含量检测。在5±3℃环境中进行长期稳定性测试,在第3、6、9、12、18、24、30个月进行血凝素含量检测。取保存6个月、24个月和30个月后的疫苗,对小鼠进行免疫,评估该疫苗的免疫原性。以血凝抑制和微量中和滴度来评价抗体反应。同时利用存放30个月的MF59佐剂疫苗进行二次免疫后,对小鼠进行攻毒,观察MF59佐剂疫苗的免疫保护效应。研究结果:H7N9裂解佐剂(MF59)疫苗,在37±2℃环境下可保存3天,在25±2℃可保存3个月,在5±3℃至少可保存30个月。各项指标均达到药典关于疫苗评价的标准。在保存30个月后,佐剂疫苗免疫后抗体血凝抑制效价和微量中和滴度没有明显的变化,免疫小鼠能够有效抵御H7N9病毒的感染及其致病效应。研究结论:我们的研究结果表明H7N9裂解(MF59)佐剂疫苗具有很好的稳定性。在5±3℃至少可保存30个月,适合大流行疫苗储备。第三章:A/ZJU01/PR8/2013裂解H7N9疫苗对高致病H7N9感染的小鼠的保护效应研究研究背景:自从第一例H7N9以来,已经有5波H7N9高峰,2017年出现新的高致病性H7N9毒株,为了评价A/ZJU01/PR8/2013疫苗是否还对高致病性H7N9毒株有保护效应,我们开展了此项研究。研究方法:用500μ1裂解疫苗(2.5μg HA和7.5μg HA两个剂量)或者MF59佐剂疫苗腹腔二针免疫小鼠,采集第二次免疫后14天血清,体外做血凝抑制实验,用于评价免疫血清对高致病性H7N9毒株的抗体水平。同时,对免疫后小鼠进行高致病性H7N9毒株攻毒,观察1周,2周后小鼠的生长状态,后杀死小鼠取肺进行病理及肺部病毒量检测,同时检测免疫效应。研究结果:免疫血清能够中和高致病性毒株,与ZJU01毒株比较,效价有所下降。动物实验表明,高致病性H7N9毒株对小鼠致病力明显大于ZJU01毒株,但是疫苗仍然能有效保护,MF59佐剂疫苗效果更好。研究结论:以ZJU01毒株为模板研发的H7N9裂解/佐剂疫苗,能有效地保护模型小鼠抵御高致病性H7N9的感染及其所致的病理效应。MF59佐剂疫苗的保护效果更好。当然,进一步的临床试验应该开展,同时也应该及时更新疫苗以发挥更好的效果。