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目的:研究低糖对eNOS(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)翻译后修饰的影响,并进一步探讨低糖影响翻译后修饰的可能机制。研究低糖对eNOS活性的影响。探寻eNOS在低糖条件下的O-乙酰氨基葡萄糖修饰位点。
方法:低浓度葡萄糖培养基培养牛主动脉内皮细胞(Bovine aortic endothelial cells, BAECs)、HEK293细胞建立低糖细胞模型;胰岛素皮下注射建立急性低血糖大鼠模型。2′,5′-ADP-琼脂糖凝胶、His标签蛋白纯化凝胶分别纯化eNOS、His标签eNOS;免疫沉淀法纯化N-乙酰葡萄糖胺转移酶(O-linked N-acetylglucosamine transferase, OGT)。免疫印迹法检测蛋白表达、翻译后修饰水平以及翻译后修饰相关机制。液相色谱-质谱联用技术(High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry , HPLC-MS )与串联质谱检索(MS/MS ion search)探寻eNOS在低糖条件下的O-乙酰氨基葡萄糖的修饰位点。格里斯试剂法(Griess reagent)、Elisa、放射性同位素标记法分别检测BAEC、SD-大鼠胸主动脉、转染细胞中eNOS的活性。微血管张力测定仪检测大鼠离体血管内皮依赖性舒张功能。
结果:经低糖处理后,BAECseNOSO-乙酰氨基葡萄糖修饰水平显著上升,丝氨酸(Serine, Ser)-1179位点磷酸化修饰水平无明显变化;OGT表达、磷酸化修饰水平显著增加;敲低AMPK-α1的表达可以逆转低糖引发的O-乙酰氨基葡萄糖修饰水平上升。低血糖大鼠胸主动脉eNOS翻译后修饰水平变化与BAECs中无异。经低糖处理后,转染细胞中人来源野生型、Ser738位点突变型、Ser867位点突变型eNOS翻译后修饰水平变化与BAECseNOS无异;转染细胞中人来源Ser1177位点突变型eNOS除Ser-1177位点磷酸化位点不能被检测外,其O-乙酰氨基葡萄糖修饰修饰水平变化与BAECseNOS无异;转染细胞中人来源Threonine(Thr)866位点突变型eNOSO-乙酰氨基葡萄糖修饰与Ser-1177位点磷酸化修饰水平均无明显改变。人来源Thr866位点突变型eNOS与人来源野生型eNOS相比,其活性显著增加。经低糖处理后,BAECs培养基与大鼠胸主动脉血浆中NO含量显著上升。经低糖处理后,BAECseNOSThr-495位点磷酸化修饰水平显著下降;PKCα表达水平伴随着Thr-497磷酸化修饰水平的下降而显著降低,PP1表达水平无明显变化;过表达PKCα或阻断PKCα降解能导致低糖引发的Thr-497去磷酸化修饰现象消失。敲低AMPK-α1的表达可以逆转低糖引发的PKCα降解与Thr-497去磷酸化修饰;激活AMPK可以引起PKCα降解与Thr-497去磷酸化修饰。低血糖大鼠胸主动脉eNOS翻译后修饰水平变化与BAECs中无异。低血糖大鼠胸主动脉、肠系膜动脉舒张曲线明显左移,半效剂量显著降低。
结论:(1)低糖条件下eNOS酶活性的增加是通过Thr-866位点O-乙酰氨基葡萄糖修饰水平上调引起的,其机制可能为AMPK的激活导致OGT的表达增加,进而引发O-乙酰氨基葡萄糖修饰水平的上升。(2)低糖条件下内皮依赖性舒张功能的改善是通过增加eNOS酶活性引起的,其机制可能为AMPK的激活导致PKCα经泛素-蛋白酶体途径降解,进而引发Thr-497位点去磷酸化。
方法:低浓度葡萄糖培养基培养牛主动脉内皮细胞(Bovine aortic endothelial cells, BAECs)、HEK293细胞建立低糖细胞模型;胰岛素皮下注射建立急性低血糖大鼠模型。2′,5′-ADP-琼脂糖凝胶、His标签蛋白纯化凝胶分别纯化eNOS、His标签eNOS;免疫沉淀法纯化N-乙酰葡萄糖胺转移酶(O-linked N-acetylglucosamine transferase, OGT)。免疫印迹法检测蛋白表达、翻译后修饰水平以及翻译后修饰相关机制。液相色谱-质谱联用技术(High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry , HPLC-MS )与串联质谱检索(MS/MS ion search)探寻eNOS在低糖条件下的O-乙酰氨基葡萄糖的修饰位点。格里斯试剂法(Griess reagent)、Elisa、放射性同位素标记法分别检测BAEC、SD-大鼠胸主动脉、转染细胞中eNOS的活性。微血管张力测定仪检测大鼠离体血管内皮依赖性舒张功能。
结果:经低糖处理后,BAECseNOSO-乙酰氨基葡萄糖修饰水平显著上升,丝氨酸(Serine, Ser)-1179位点磷酸化修饰水平无明显变化;OGT表达、磷酸化修饰水平显著增加;敲低AMPK-α1的表达可以逆转低糖引发的O-乙酰氨基葡萄糖修饰水平上升。低血糖大鼠胸主动脉eNOS翻译后修饰水平变化与BAECs中无异。经低糖处理后,转染细胞中人来源野生型、Ser738位点突变型、Ser867位点突变型eNOS翻译后修饰水平变化与BAECseNOS无异;转染细胞中人来源Ser1177位点突变型eNOS除Ser-1177位点磷酸化位点不能被检测外,其O-乙酰氨基葡萄糖修饰修饰水平变化与BAECseNOS无异;转染细胞中人来源Threonine(Thr)866位点突变型eNOSO-乙酰氨基葡萄糖修饰与Ser-1177位点磷酸化修饰水平均无明显改变。人来源Thr866位点突变型eNOS与人来源野生型eNOS相比,其活性显著增加。经低糖处理后,BAECs培养基与大鼠胸主动脉血浆中NO含量显著上升。经低糖处理后,BAECseNOSThr-495位点磷酸化修饰水平显著下降;PKCα表达水平伴随着Thr-497磷酸化修饰水平的下降而显著降低,PP1表达水平无明显变化;过表达PKCα或阻断PKCα降解能导致低糖引发的Thr-497去磷酸化修饰现象消失。敲低AMPK-α1的表达可以逆转低糖引发的PKCα降解与Thr-497去磷酸化修饰;激活AMPK可以引起PKCα降解与Thr-497去磷酸化修饰。低血糖大鼠胸主动脉eNOS翻译后修饰水平变化与BAECs中无异。低血糖大鼠胸主动脉、肠系膜动脉舒张曲线明显左移,半效剂量显著降低。
结论:(1)低糖条件下eNOS酶活性的增加是通过Thr-866位点O-乙酰氨基葡萄糖修饰水平上调引起的,其机制可能为AMPK的激活导致OGT的表达增加,进而引发O-乙酰氨基葡萄糖修饰水平的上升。(2)低糖条件下内皮依赖性舒张功能的改善是通过增加eNOS酶活性引起的,其机制可能为AMPK的激活导致PKCα经泛素-蛋白酶体途径降解,进而引发Thr-497位点去磷酸化。