背景产单核细胞李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM,简称李斯特菌)是一种可寄生于细胞内的兼性厌氧革兰阳性菌,最早于1926年由Murray从患败血症的大鼠和兔子中分离得到,对环境的耐受性强,因而可广泛存在于自然界不同的环境中,如土壤、植物、水源等处,容易污染肉、奶、海产品等食品。李斯特菌主要感染免疫功能低下患者,特别是孕妇以及老年人,可引起人或动物不同类型的李斯特菌病,如脑炎、脑膜脑炎、流产、败血症、肺炎、角膜炎等,其中婴幼儿、孕妇以及免疫耐受患者的感染死亡率可高达20%-30%。2001年至今,我国检验检疫部门已多次从美国、加拿大、法国等国家进口的奶酪及肉制品中检出产单核细胞李斯特菌。李斯特菌病的临床表现主要有脑膜脑炎型、败血症型、妊娠感染型、新生儿败血性肉芽肿型,其中在非妊娠免疫力低下的成人中,脑膜脑炎型和败血症型最为常见。产单核细胞李斯特菌已被列为20世纪90年代四大食源性致病菌之一,是第二大能引起1岁以下和60岁以上老人中枢神经系统感染的病原体,此外,李斯特菌也是引起发展中国家社区获得性细菌性脑膜炎的主要致病菌之一。人类中枢神经系统李斯特菌病的临床表现有多种,包括脑膜炎、脑干脑炎、脉络丛脑膜炎。虽然抗生素能有效杀灭细菌,但包括李斯特菌病在内的细胞内细菌感染仍面临着严峻的挑战,其主要的原因之一是大多数的抗生素无法杀灭进入细胞内的病原菌,并且抗生素疗法相对忽视了宿主的抗菌机制。因此,寻找新一代抗细胞内细菌感染的药物,是临床治疗李斯特菌病亟待解决的问题。c-Met是一种由c-met原癌基因编码的蛋白产物,为间质细胞来源的肝细胞生长因子／分散因子(human hepatocyte growth factor/scatter factor, HGF/SF)的受体,具有酪氨酸激酶活性,与多种癌基因产物和调节蛋白相关。病原微生物通过其自身摄入和转运,穿越正常防御组织屏障而侵入宿主组织器官。但某些病原菌可进行生物模拟,模拟宿主受体相应的天然配体分子,这种现象,即所谓的“细菌直接的转胞吞作用”,在细菌侵袭上皮和内皮细胞中都可见到。产单核细胞李斯特菌可穿越宿主的三个屏障—肠屏障、血脑屏障和胎盘屏障,侵入机体后可以在专职和非专职吞噬细胞中生存和繁殖,其感染过程包括：内化、逃离吞噬泡、李斯特菌在宿主细胞内的极性运动与细胞间传播。李斯特菌在黏附侵袭相关毒力因子的作用下,进入宿主细胞。内化素(internalins)是其中一种重要的黏附侵袭相关毒力因子,能够识别宿主细胞上的相关受体。内化素A(InlA)、内化素B(InlB)通过LRR结构域(亚单位)与特异性受体相结合,InlA与钙黏蛋白结合,介导细菌进入上皮细胞；而InlB模拟天然配体肝细胞生长因子／分散因子,能与肝细胞生长因子／分散因子受体(c-Met)结合,介导细菌穿越肝细胞、成纤维细胞、上皮细胞等。InlB与脂筏上的c-Met结合,诱导Cb1、Gab1、Shc和Grb2蛋白的聚集,紧接着p85/p110 I家族PI-3激酶聚集,PI-3激酶将PI(4,5)P2(PIP2)转换为PI (3,4,5) P3(PIP3),促使一种未知的蛋白聚集激活Rac, Rac间接激活LIM激酶,调控cofilin对肌动蛋白的聚合和解聚,介导李斯特菌内化。因此,靶向InlB介导的侵袭过程,是探索特异性阻断李斯特菌细胞内感染的重要途径。作为InlB受体, c-Met是阻断李斯特菌感染的良好靶点。格尔德霉素(Geldanamycin, GA)为茴香霉素(Anisomycin)抗生素家族成员,是苯醌袢霉素家族的原型药物,已证实格尔德霉素可以破坏癌细胞中的c-Met-GF/SF轴心,能特异性阻断c-Met中酪氨酸磷酸化,是c-Met信号传导通路的特异抑制剂。HGF/SF-c-Met通路与人类肿瘤的发生和转移相关,且在李斯特菌入侵宿主细胞过程中起重要作用。格尔德霉素对移植瘤表现出抗肿瘤活性,但其剂量依赖的致死性肝细胞毒性、胃肠道损伤和肾毒性,不适合作为药物进一步研发。格尔德霉素类似物,如17-AAG和17-DMAG,能影响与肿瘤细胞增殖和存活有关的信号通路中的多个靶点,例如：能特异性阻断c-Met中酪氨酸磷酸化和破坏热休克蛋白Hsp90伴侣蛋白的功能,这些靶点与肿瘤发生和病原感染等多种病理生理功能改变相关。17-AAG和17-DMAG通过与格尔德霉素相同的机制发挥抗肿瘤作用,但比格尔德霉素有更高的血浓度和较小的肝脏毒性,是c-Met信号传导通路的潜在抑制剂,可作为药物研发。卡博替尼(Cabozantinib)是一种口服的多种受体酪氨酸激酶抑制剂,美国食品药品管理局(FDA)已批准卡博替尼用于转移性甲状腺髓样癌的治疗。细胞和动物实验已证实：卡博替尼能够调节Met信号通路,从而抑制肿瘤细胞的增殖。近期临床研究证明：卡博替尼能够治疗甲状腺髓样癌和前列腺癌,并且具有安全剂量范围。本研究建立产单核细胞李斯特菌感染小鼠模型,通过比较小鼠生存曲线、细菌载量、血清IL-10和NF-κB p65含量、脑组织依文思蓝含量以及脑组织病理变化,验证c-Met抑制剂17-AAG和卡博替尼对李斯特菌体内感染的阻断作用,探讨c-Met抑制剂作为李斯特菌感染治疗药物的可行性。目的通过小鼠动物体内试验,研究c-Met抑制剂17-AAG和卡博替尼对李斯特菌体内感染的阻断作用,探讨c-Met抑制剂作为李斯特菌感染治疗药物的可行性,寻找细胞内细菌感染的治疗新策略。研究方法一、17-AAG对李斯特菌小鼠体内感染的阻断作用1、生存曲线分析将小鼠随机分为4组：17-AAG组、氨苄青霉素组、17-AAG联合氨苄青霉素组、PBS对照组,每组8只,每只小鼠腹腔注射1×106CFU李斯特菌,并分别在感染后6h、12h、24h给药,分别腹腔注射17-AAG 5μg/g、腹腔注射氨苄青霉素20μg/g、腹腔注射17-AAG 5μg/g后腹腔注射20μg/g氨苄青霉素、以及腹腔注射等量PBS。每天记录观察小鼠的临床症状和生存情况,共5d。2、血液、脑、肝、脾细菌计数(1)剂量依赖效应取24只小鼠,将小鼠随机分为0、2μg/g、5μg/g、10μg/g17-AAG四种剂量组,每组6只。每只小鼠腹腔注射5×105CFU李斯特菌,分别于给菌前2小时和给菌后24h腹腔注射相应剂量17-AAG,给菌后48h,给予小鼠10%水合氯醛200μL,打开其胸腔,从心尖处抽取200μL血液,倍比稀释后,涂布于BHI固体培养基进行细菌计数。灌洗后无菌打开头颅,取出脑组织,用组织匀浆器研磨,倍比稀释后,计数细菌菌落数。取其肝脏和脾脏,加入1mLPBS研磨成匀浆,倍比梯度稀释后,涂布于BHI固体培养基中,计数平板菌落数。48h内死亡小鼠应立即解剖取其血液、脑、肝、脾。(2)协同作用取24只小鼠,随机分为17-AAG组、氨苄青霉素组、17-AAG联合氨苄青霉素组、PBS对照组,每组6只。每组小鼠腹腔注射李斯特菌100μl(5×106CFU/mL),分别在感染后2h、6h、24h给药,各组分别腹腔注射17-AAG5μg/g、腹腔注射氨苄青霉素20μg/g、腹腔注射17-AAG 5μg/g后腹腔注射20μg/g氨苄青霉素、以及腹腔注射等量PBS。给菌48h后,解剖小鼠,取其心脏血、脑组织、肝脏、脾脏,涂布于BHI固体平板,计数细菌数。3、循环血脑微血管内皮细胞(cBMECs)的计数(1)剂量依赖效应小鼠随机分为0、2μg/g、5μg/g、10μg/g17-AAG四种剂量组,每只小鼠腹腔注射5×105CFU李斯特菌,分别于给菌前2h和给菌后24h腹腔注射相应剂量17-AAG,给菌后48h解剖小鼠,取心脏血液,并裂解红细胞。按照说明书准备好磁珠,并用Hanks平衡盐溶液和5%FBS混合液(HBSS+5%FCS)重悬至终浓度为4×108个/mL。血液标本中的内皮细胞被UEAI lectin包被的磁珠吸附后,被海藻糖洗脱,然后又重新吸附于MSFD2抗体包被的磁珠上。这些内皮细胞表达CD146分子,提示其内皮细胞来源,同时表达MSFD2分子,表明其来源自脑部。通过PE包被的CD146抗体标记吸附在MSFD2抗体包被磁珠上的细胞,转移至细胞计数器上,荧光下计数血液标本中的cBMECs数量。(2)协同作用小鼠随机分为17-AAG组、氨苄青霉素组、17-AAG联合氨苄青霉素组、PBS对照组,每只小鼠腹腔注射5×105CFU李斯特菌,分别在感染后2h、6h、24h给药,各组分别腹腔注射17-AAG5μg/g、腹腔注射氨苄青霉素20p,g/g、腹腔注射17-AAG 5μg/g后腹腔注射20μg/g氨苄青霉素、以及腹腔注射等量PBS,给菌48h后,解剖取其心脏血,计数cBMECs。4、脑组织中依文思蓝(EB)含量的测定(1)剂量依赖效应小鼠随机分为不同17-AAG剂量组,给菌给药,方法同2(1),于解剖前3h腹腔注射EB (50μg/g),存活3h后,麻醉,用30mL预冷PBS心脏灌注,打开头颅,取出脑组织,放入含有1mL去离子甲酰胺的EP管内,50℃水浴48h,5200rpm离心10min,取上清液,620nm分光光度计测定吸光度,根据吸光度在绘制的标准曲线中查得EB的浓度。(2)协同作用小鼠随机分为17-AAG组、氨苄青霉素组、17-AAG联合氨苄青霉素组、PBS对照组,给菌给药,方法同2(2),于解剖前3h腹腔注射EB,测定脑组织中EB含量。5、脑脊液(CSF)中NF-κB p65的测定(1)剂量依赖效应小鼠随机分为不同17-AAG剂量组,给菌给药,方法同2(1),给菌48h后,解剖小鼠,取出小鼠脑组织,用200μLPBS冲洗脑室和颅腔以收集脑脊液,10μLCSF中含有10个红细胞的标本视为污染标本,然后用小鼠NF-κB p65 ELISA试剂盒测定脑脊液中p65的含量。(2)协同作用小鼠随机分为17-AAG组、氨苄青霉素组、17-AAG联合氨苄青霉素组、PBS对照组,给菌给药方法同2(2),给菌48h后,取其CSF测定p65含量。6、IL-10的检测小鼠随机分为17-AAG组、氨苄青霉素组、17-AAG联合氨苄青霉素组、PBS对照组,给菌用药方法同2(2),给菌48h后,解剖小鼠,采集心脏血,于2-8℃5200rpm离心15分钟,30分钟内收集好血清,用IL-10 ELISA试剂盒检测IL-10含量。7、肝脏病理学分析采集PBS对照组和10μg/g17-AAG剂量组小鼠肝脏组织,于10%甲醛固定后,经水洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、修块、切片、贴片、烤片、HE染色、封片后,于显微镜下进行病理观察。二、卡博替尼对李斯特菌小鼠体内感染的阻断作用1、生存曲线分析将小鼠随机分为4组：卡博替尼组、氨苄青霉素组、卡博替尼联合氨苄青霉素组、PBS对照组,每组9只,每只小鼠腹腔注射1×106CFU李斯特菌,并分别在感染后6h、12h、24h给药,各组分别灌胃给予卡博替尼20gg/g、腹腔注射氨苄青霉素20μg/g、灌胃卡博替尼20μg/g后腹腔注射20μg/g氨苄青霉素、以及腹腔注射等量PBS,每天记录观察小鼠的临床症状和生存情况,共5d。2、血液、脑组织细菌计数(1)剂量依赖效应将小鼠随机分为0.10μg/g、20μg/g、30μg/g卡博替尼四种剂量组,每组5只。每只小鼠腹腔注射5×105CFU李斯特菌,分别于给菌前2h和给菌后24h灌胃相应剂量卡博替尼。给菌后48h,给予小鼠10%水合氯醛200μL,打开其胸腔,从心尖处抽取200μL血液,倍比稀释后,涂布于BHI固体培养基进行细菌计数。灌洗后无菌打开头颅,取出脑组织,用组织匀浆器研磨,倍比稀释后,计数细菌菌落数。(2)协同作用将小鼠随机分为卡博替尼组、氨苄青霉素组、卡博替尼联合氨苄青霉素组、PBS对照组,每只小鼠腹腔注射5×105CFU李斯特菌,分别在感染后2、6、24h给药,各组分别灌胃给予卡博替尼20gg/g、腹腔注射氨苄青霉素20μg/g、灌胃卡博替尼20μg/g后腹腔注射20μg/g氨苄青霉素、以及腹腔注射等量PBS,给菌后48h,无菌取其血液和脑组织,计数细菌菌落数。3、循环血脑微血管内皮细胞的计数小鼠随机分为卡博替尼组、氨苄青霉素组、卡博替尼联合氨苄青霉素组、PBS对照组,给菌给药方法同2(2),感染李斯特菌48h后,解剖取其心脏血,并裂解红细胞。按照说明书准备好磁珠,并用Hanks平衡盐溶液和5%FBS混合液(HBSS+5 %FCS)重悬至终浓度为4×108个/mL。血液标本中的内皮细胞被UEAIlectin包被的磁珠吸附后,被海藻糖洗脱,然后又重新吸附于MSFD2抗体包被的磁珠上。这些内皮细胞表达CD146分子,提示其内皮细胞来源,同时表达MSFD2分子,表明其来源自脑部。通过PE包被的CD146抗体标记吸附在MSFD2抗体包被磁珠上的细胞,转移至细胞计数器上,荧光下计数血液标本中的cBMECs数量。4、IL-10的检测小鼠随机分为卡博替尼组、氨苄青霉素组、卡博替尼联合氨苄青霉素组、PBS对照组,给菌用药方法同2(2),给菌48h后,采集心脏血,于2-8℃5200rpm离心15分钟,30分钟内收集好血清,用IL-10ELISA试剂盒检测IL-10含量。5、脑脊液中NF-κB p65的测定小鼠随机分为卡博替尼组、氨苄青霉素组、卡博替尼联合氨苄青霉素组、PBS对照组,给菌用药方法同2(2),解剖小鼠,取出小鼠脑组织,用200μLPBS冲洗脑室和颅腔以收集脑脊液(CSF),10μLCSF中含有10个红细胞的标本视为污染标本,然后用小鼠NF-κB p65 ELISA试剂盒测定脑脊液中p65的含量。6、脑组织中依文思蓝含量的测定小鼠随机分为卡博替尼组、氨苄青霉素组、卡博替尼联合氨苄青霉素组、PBS对照组,给菌给药方法同2(2),小鼠于解剖前3h腹腔注射EB (50μg/g),存活3h后,麻醉,用30mL预冷PBS心脏灌注,打开头颅,取出脑组织,放入含有1mL去离子甲酰胺的EP管内,50℃水浴48h,5200rpm离心10min,取上清液,620nm分光光度计测定吸光度,根据吸光度在绘制的标准曲线中查得EB的浓度。7、脑组织病理学分析采集脑组织,于10%甲醛固定后,经水洗、脱水、透明、浸蜡、包埋、修块、切片、贴片、烤片、HE染色、封片后,于显微镜下进行病理观察。统计学分析本研究的数据采用均数±标准差表示,两组的比较运用t检验,运用GraphPad Prism 5软件进行统计学分析,以P<0.05为差异有统计学意义,检验水准为a=0.05。结果一、17-AAG对李斯特菌小鼠体内感染的阻断作用1.17-AAG组、氨苄青霉素组、17-AAG联合氨苄青霉素组感染小鼠的生存率均明显高于PBS对照组。2.17-AAG呈剂量依赖性抑制李斯特菌在小鼠血液、脑组织、肝脏、脾脏的增殖,并呈剂量依赖性减少血液cBMECs数量、脑组织中EB含量、脑脊液中NF-κB p65含量。3.17-AAG联合氨苄青霉素组相比单独用药组,小鼠血液、脑组织、肝脏、脾脏的李斯特菌数量、cBMECs数量、脑组织中EB含量、脑脊液中NF-κB p65含量均显著降低。4.17-AAG用药组相比PBS对照组,小鼠肝脏组织病理变化减轻。二、卡博替尼对李斯特菌小鼠体内感染的阻断作用1.卡博替尼组、氨苄青霉素组、卡博替尼联合氨苄青霉素组感染小鼠的生存率明显高于PBS对照组。2.卡博替尼呈剂量依赖性降低感染小鼠血液、脑组织中李斯特菌数量。3.卡博替尼联合氨苄青霉素用药组相比于单独用药组,外周血cBMECs数量、脑组织中EB含量、脑脊液中NF-κB p65含量、血液IL-10含量均显著降低。4.联合用药组和单独用药组脑组织炎症变化均较PBS组减轻,其中联合用药组仅见少量的炎症细胞。结论由上可见：c-Met受体酪氨酸激酶抑制剂17-AAG和卡博替尼能够在一定程度上抑制李斯特菌在小鼠体内增殖,阻断李斯特菌菌血症和脑膜炎的发生,并与氨苄青霉素可能具有一定程度上的协同作用。