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目的角膜移植是治疗不可逆性致盲性角膜病变的最有效的治疗手段,也是成功率最高的固体器官移植手术。尽管眼具有“免疫赦免”功能,但移植排斥反应仍是导致角膜移植手术失败的首要原因。由于角膜移植片在结构上直接与前房相连,移植片的存活时间被认为与植片中异体抗原诱发的前房相关性免疫偏离(anterior chamber–associated immune deviation ,ACAID)能力紧密相关。房水中含有多种免疫抑制因子,如TGF-β可促使树突状细胞(dendritic cells,DC)维持在不成熟状态,当这种不成熟型DC在眼内摄取异体抗原后迁移至脾脏内,在NKT细胞和B细胞存在的条件下,将促使某些抗原特异性T细胞转化成为调节性T细胞(regulatory T cells,Treg),抑制迟发型超敏反应(delayed-type hypersensitivity, DTH)。近年来,人们对T细胞的免疫调节作用有了新的认识和兴趣,意识到抑制性调节性T细胞的存在,并认为这群调节性T细胞在诱发移植耐受和治疗自身免疫性疾病中起关键作用。目前Treg被定义为两类,一类为胸腺来源的天然Treg(natural regulatory T cells/nTreg or innate Treg);另一类为外周诱导产生的获得性Treg(inducible regulatory T cells/iTreg or adaptive Treg)。最近越来越多的过继转移实验研究认为,CD4+CD25+Treg可以推迟甚至治疗同种异体移植物排斥反应,在诱发移植免疫耐受中作用显著;因此,认为天然CD4+CD25+Treg被认为可以作为过继转移细胞,在治疗器官移植排斥反应和自身免疫性疾病方面具有巨大的临床应用潜能。但是目前主要有三方面的原因限制了CD4+CD25+Treg的临床应用。首先,天然CD4+CD25+Treg的数量非常少,仅占外周CD4+T细胞的4%～10%;其次,关于CD4+CD25+Treg抗原特异性的研究仍很缺乏,具有抗原特异性的CD4+CD25+Treg可能达到更有效地治疗目的,并能减少免疫治疗中的副作用;最后,关于CD4+CD25+Treg诱导免疫耐受方面的机制还不十分清楚。而眼的结构特征,为局部地或系统地研究Treg的免疫调节作用提供了一个新的平台。本研究的目的是通过建立小鼠角膜移植模型,研究同种异体角膜移植排斥反应中的Treg变化特点,探讨TGF-βDC诱导抗原特异性Treg的可行性,比较不同来源Treg对角膜移植排斥反应免疫抑制作用的异同,为临床有效调控、治疗角膜移植排斥反应及其他自身免疫性疾病提供重要的理论依据。方法1.建立小鼠原位角膜移植模型,临床观察比较自体和同种异体移植片的存活时间和排斥曲线;RT-PCR检测同种异体移植术后不同时间点植片内细胞因子mRNA的表达水平;自体或同种异体角膜移植后3d,流式细胞术分析(flow cytometric analysis,FACS)分析颌下淋巴结(submandibular lymph node,SMLN)、颈浅淋巴结(superficial cervical lymph node、SCLN)及脾淋巴细胞(splenic lymphocytes,SPL)中Treg的数量和表型。2.未成熟的树突状细胞(immature dendritic cells,iDCs)来源于小鼠骨髓(bone marrow,BM),在低浓度粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)培养条件下诱导生成,并联合0.2ng/ml TGF-β2下使DC维持在不成熟状态。iDC通过与供体来源的可溶性抗原(soluble antigen ,sAg)共孵育摄取供体抗原。将这种已摄取供体抗原的自体TGF-β2 DC或PBS经尾静脉注射给小鼠,3d后FACS分析TGF-β2 DC对SPL中Treg数量和表型的影响。3. FACS分别分析正常小鼠脾脏中CD4+/CD4+CD25+/CD4+CD25-三个细胞亚群的表型;采用二步磁性细胞分选法(magnetic cell sorting,MACS)纯化小鼠脾脏CD+CD25+Treg,并对分离后的细胞表型进行鉴定。4. Balb/c小鼠分别给予PBS、TGF-βDC、天然Treg和获得性Treg,尾静脉注射,3d后进行同种异体原位角膜移植,临床观察植片存活时间和排斥曲线;FACS分析移植术后3d小鼠SPL中Treg数目和表型的变化。结果1.①自体角膜移植不发生排斥反应;所有同种异体角膜移植片在术后8d~24d均被排斥,平均存活时间为17.8±4.66d。②细胞因子表达水平在术后3d～1wk达到高峰,在此期间以TNF-α增高最为显著。③与自体角膜移植相比较,同种异体角膜移植术后3d ,小鼠SCLN和SPL中CD4+CD25+Treg细胞数量显著增高(P<0.01),占CD4+T细胞的比例分别达到9.29%和8.82%;SMLN、SCLN及SPL内CD4+CD25+Foxp3+细胞比例明显上升(P<0.01),其中CTLA-4+的表达有上升,但无显著统计学差异(P>0.05),而CD28+的表达有明显下降(P<0.05)。2. TGF-βDC提高了CD4+CD25+Treg细胞数量和功能:TGF-βDC诱导后,SPL中的CD4+CD25+细胞比例由5.52%上升至16.19% ( P<0.01 ),CD4+CD25+Foxp3+细胞比例也明显明显上升(P<0.01);CD4+CD25+细胞中CTLA-4表达由69.49%上升至84.29%(P<0.01),而CD28的表达由89.71%下降至67.13%(P<0.01)。3.①在这些CD25表达水平不同而划分的三群正常小鼠天然CD4+T细胞,呈现出其它细胞表型表达的不同。Foxp3、CTLA-4、GITR、CD69在CD4+CD25+细胞亚群呈显著性高表达(P<0.01),CD4+CD25+T细胞主要存在于CD45RB低表达细胞亚群,CD28的表达在CD4+CD25+细胞亚群明显下降(P<0.05)。②使用二步MACS法从正常小鼠脾脏中分离CD4+CD25+T淋巴细胞的得率为1%～1.2%,获得纯度为87.29%～92.04%。FACS分析结果显示,Foxp3优先地表达于CD4+CD25+T细胞亚群(66.6±1.033%),而在CD4+或CD4+CD25-T细胞亚群呈低水平表达( 23.97±1.997%,16.78±3.24%);CTLA-4在CD4+CD25+T细胞亚群表达(77.37±1.67%)明显高于在CD4+(21.97±2.39%)或CD4+CD25- (18.04±3.16%)T细胞亚群的表达;纯化的CD4+CD25+T细胞亚群表现为CD127的低表达。4.①获得性Treg注射组显著抑制了同种异体角膜移植排斥反应:PBS注射组,所有移植片在术后10d～22d均发生排斥反应;TGF-βDC注射组,术后34d时1例发生明显混浊,术后38d时所有植片均发生排斥反应;天然Treg注射组,术后38d内植片保持透明,术后46d时所有植片均出现明显混浊;获得性Treg注射组,直至术后60d所有移植片未发现明显的排斥反应。4组角膜移植片的存活时间分别为16.50±4.3d、37.8±2.04、41.5±2.59和>60d,采用NPar检验说明4组间均有差别(P<0.05)。②同种异体角膜移植术后3d,小鼠SPL中CD4+CD25+、CD4+CD25+Foxp3+、CD4+CD25+CTLA-4+细胞比例在PBS注射组、TGF-βDC注射组、天然Treg注射组、获得性Treg注射组间有显著性差异(P<0.01)。对T细胞抑制功能的调节以获得性Treg注射组为著(P<0.01)。结论1.同种异体抗原是引起角膜移植排斥反应的重要的启动原因;小鼠同种异体角膜移植后颈浅淋巴结和脾脏中Treg细胞比例增高,可能参与了ACAID的形成机制。TNF-α是角膜移植术后局部参与调控的主要因子,它与Treg参与调控ACAID形成之间的关系有待进一步研究。2. TGF-βDC在体内可以有效地扩增Foxp3+CD4+CD25+Treg的数目和功能;结合第四部分的研究结果进一步说明Treg也参与了DC对角膜移植排斥反应的免疫调节作用。国内外文献未见报道。3.以CD25表达水平不同而划分的三群正常小鼠体内天然CD4+T细胞,呈现出一些细胞表型表达的不同,如Foxp3,CTLA-4, GITR,CD45RB,CD69,CD28。MACS阴性加阳性二步分选法避免激惹CD4分子,可以获得高纯度的且具有天然CD4+CD25+ Treg细胞表型及功能特征的细胞。国内无类似报道。4.经诱导产生、以间接方式获取异体抗原特异性的Treg具有更强的抑制功能,更有效地抑制了角膜移植排斥反应,而且这种方法在未来临床免疫治疗上具有实用性。这是国内、外首次在移植排斥反应中比较了经DC体内诱导产生的Treg与天然Treg免疫调节作用的异同。