近年来,恶性肿瘤的发病率和死亡率居高不下,影响了人们的身体健康。尽管目前有很多治疗恶性肿瘤的方法,比如手术治疗、放射治疗、化学治疗,但是均存在很多不足,而药物靶向治疗由于其特异性强,毒副作用小,给药剂量少等优势,逐渐成为治疗恶性肿瘤的主要方法。但目前靶向药物所针对的靶点,仍然存在特异性不高、肿瘤靶向性不强等缺点,因此需要寻找在肿瘤细胞上特异性高表达的靶点。Cripto-1是一个典型的癌基因,在细胞的迁移、侵袭以及血管生成中发挥重要作用。并且Cripto-1在人正常组织细胞中低表达或不表达,而在一些恶性肿瘤细胞中异常高表达,因此Cripto-1可作为筛选抗肿瘤药物的有效靶点。1.靶向启动子和mRNA 3’UTR的Cripto-1表达抑制剂的筛选及鉴定在本论文中,我们通过PCR技术在Hela细胞扩增了Cripto-1启动子区域,并且将它与载体pGL3-basic进行连接,成功构建了pGL3-Cripto-1启动子荧光素酶报告载体,经检测发现我们所钓取的Cripto-1启动子片段具有比较高的启动子活性,能够进行后续的化合物初筛复筛实验。之后,我们将Cripto-1启动子和之前构建的Cripto-1 mRNA 3’UTR转入细胞构成了化合物筛选模型,对400余种中药单体化合物进行筛选。结果发现化合物T150、T173分别对Cripto-1启动子和Cripto-1 mRNA 3’UTR的活性有较为明显的抑制作用,并且T150、T173可以抑制Cripto-1蛋白的表达。2.Cripto-1表达抑制剂的体外抗肿瘤活性研究由于Cripto-1可以促进肿瘤的发生,所以我们检测了T150、T173的抗肿瘤活性。通过MTT法检测T150、T173对细胞活力有何影响,实验结果表明,相比于正常细胞这两种化合物对肿瘤细胞的活力抑制作用更为强烈,而且通过计算发现它们对肿瘤细胞系Hela和HepG2的IC50和IC10值小于相对应的正常细胞系,而且T150在对正常细胞毒性较低的浓度下即可发挥抗肿瘤作用。3.Cripto-1表达抑制剂体外抗肿瘤活性的细胞生物学机制研究化合物通过抑制肿瘤细胞的增殖能力,并且促进它的凋亡发生,可以达到抑制肿瘤发生发展的功能。因此我们首先探究了T150、T173对肿瘤细胞增殖能力的影响。通过流式细胞检测技术发现,T150、T173可以影响Hela细胞正常的周期运转,并使其停滞在S期,通过对相关周期蛋白检测发现,T150、T173使周期调控蛋白CyclinA和CDK2的表达量下降,而细胞周期负调控因子p21的表达上升,因此抑制了细胞增殖能力。然后,我们探究了T150、T173是否能够导致肿瘤细胞发生凋亡,通过DAPI染色发现,被这两种化合物处理后的肿瘤细胞出现了凋亡小体,并伴有核小体碎片增多的现象;通过流式细胞检测技术发现,T150、T173处理后的凋亡细胞比例明显增多;对相关凋亡蛋白检测发现,T150、T173处理组细胞中cleaved-caspase3、cleaved-caspase9、促凋亡蛋白Bax蛋白表达量上升,凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达量下降,由此可初步得出这两种化合物可能是通过线粒体途径使细胞发生凋亡。最后,通过划痕实验检测了T150、T173对肿瘤细胞迁移能力的影响。实验结果显示T150、T173能够显著抑制肿瘤细胞的迁移能力;对与迁移相关的蛋白检测发现,上皮细胞标志物E-cadherin的表达量升高,间质细胞标志物N-cadherin、波形蛋白Vimentin的表达量降低。这些实验结果提示T150、T173具有体外抗肿瘤活性。综上所述,本研究中以Cripto-1为靶点的抗肿瘤化合物筛选模型具有一定功效,并且通过其所筛选出的T150和T173能够抑制肿瘤细胞增殖、侵袭、迁移能力,促进肿瘤细胞凋亡,因此本研究为Cripto-1高表达的恶性肿瘤的研究和治疗提供了新的候选化合物。