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自噬是指将细胞质中的一些组分,例如受损的或冗余细胞器、蛋白质运输到溶酶体或者液泡中降解的过程。在能量匮乏的条件下,自噬被激活,通过调节各种生物代谢途径以抵消不利因素,从而维持细胞稳态。目前,已鉴定出40余个自噬相关基因（Autopahgy genes,ATGs）。过氧化物酶体是细胞中至关重要的细胞器,主要功能是催化脂肪酸β-氧化和自由基的清除。毕赤酵母细胞中冗余的过氧化物酶体经葡萄糖或者乙醇诱导后,会经过选择性自噬过程在液泡内降解,这个过程又被称为过氧化物酶体自噬。毕赤酵母细胞过氧化物酶体自噬需依赖于其受体Atg30才能完成。过氧化物酶体基质蛋白进入过氧化物酶体有两条通路:PTS1和PTS2通路。硫解酶（Thiolase,Pot1）蛋白是一种带有PTS2信号的过氧化物酶体基质蛋白,经PTS2通路进入过氧化物酶体。Pot1的受体是Pex7和Pex20。当PEX7被敲除之后,Pot1就无法进入过氧化物酶体,定位在细胞质中。Pot1在油酸培养基诱导后会大量增殖,转到SD-N培养基后,会进行自噬。实验室前期工作发现胞质定位的Pot1是通过一条新的、不依赖于Atg30的方式降解。那么胞质定位的Pot1是通过何种方式降解?我们将Pot1连接GFP使其表达绿色荧光蛋白,可以在荧光显微镜下观察绿色荧光存在的位置来判断Pot1的降解情况。1.胞质定位的Pot1通过选择性细胞自噬进入液泡降解Atg1是参与细胞自噬过程的核心蛋白,实验发现在Δpex7Δatg1::Pot1-GFP的菌株中Pot1无法进入液泡降解,而在Δpex7::Pot1-GFP菌株中Pot1在10 h时就已经进入液泡,说明胞质定位的Pot1是通过细胞自噬进入液泡降解。Atg11是重要的选择性自噬的蛋白,因此我们在Δpex7::Pot1-GFP菌株中敲除ATG11,观察是否影响胞质定位Pot1的降解。通过荧光显微镜观察发现Δpex7Δatg11::Pot1-GFP菌株转入SD-N培养基10 h时胞质定位的Pot1不能进入液泡降解,但是24 h时进入液泡降解,说明在Δpex7Δatg11::Pot1-GFP菌株中胞质定位的Pot1进入液泡降解被延迟。然后又对Atg11是否参与胞质Pot1的降解进行了蛋白水平上的验证。通过GFP-Cleavage实验检测Pot1-GFP的降解,也证实了这个结果。因此,胞质定位的Pot1是通过选择性细胞自噬的方式进入液泡降解。2.通过随机插入突变筛选参与胞质中Pot1降解的关键基因为了鉴定参与胞质Pot1选择性自噬降解途径中其他的关键基因,利用限制性内切酶介导整合的方法,将带有博来霉素的p REMI质粒酶切线性化,通过电转整合到Δpex7::Pot1-GFP菌株基因组中,造成基因随机突变,然后将单克隆菌株培养诱导自噬10 h及24 h时,观察胞质定位的Pot1的位置,筛选Pot1在10 h和24 h不能进入液泡降解的菌株。将筛选到的突变体结合分子克隆方法与生物信息学方法进行鉴定分析。通过高通量的筛选实验,共筛选6000多个毕赤酵母突变体,鉴定了15个影响胞质Pot1降解的突变体菌株。通过分子生物学方法确定了p REMI质粒在这些突变体中基因组中的插入位点,鉴定了部分与自噬相关的基因,包括ATG2、ATG3、ATG9、ATG14、ATG101、VPS15等。另外,还筛选到部分延缓胞质Pot1降解的基因,如IMDH、RXT3、CK2、Tubulin folding factor D（本文简称TFD）等。这些蛋白是否参与酵母中的自噬以及是否特异地参与胞质Pot1的降解,仍有待于进一步的研究。3.对筛选到的延缓Pot1-GFP降解的基因进行功能验证为了验证是否由于TFD或IMDH基因突变造成的胞质Pot1降解被延迟以及排除其他因素的干扰,我们在Δpex7::Pot1-GFP菌株中通过同源重组的方法分别敲除TFD或IMDH基因,将其自噬诱导10 h及24 h并观察Pot1进入液泡降解情况。结果表明,在敲除TFD或IMDH基因的突变体菌株中,Pot1的降解被延缓,说明这两个基因确实参与了胞质Pot1的降解过程。4.通过免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）筛选与Pot1-GFP互作蛋白为了鉴定更多参与胞质Pot1降解过程的基因,我们通过免疫共沉淀的方法利用GFP-Trap纯化筛选与Pot1-GFP互作的蛋白。将Δpex7Δatg1::Pot1-GFP菌株经油酸诱导后再转入SD-N培养4小时收集菌体并纯化蛋白,经SDS-PAGE电泳后,进行质谱测序。通过质谱测序,我们筛选到Vps29、Vps41、Gpa2等几个可能与Pot1互作的蛋白。其中Gpa2蛋白含有WD40功能域,已知Pot1的受体Pex7也是含有WD40的功能域蛋白,敲除PEX7后,Gpa2有可能作为自噬受体,与定位于胞质中的Pot1结合,将Pot1运输至液泡降解。为了验证Gpa2的功能,构建了敲除GPA2的质粒,相关的工作正在进行中。