研究背景:RA是一种以关节及滑膜组织炎症为特征的慢性自身免疫性疾病。虽然RA的病因学目前并十分清楚,但是现在已达成共识:RA是由多个基因和未知的环境诱因相互作用的结果。近期有文献报道在高加索人群中, nucleotide-binding, leucine-rich repeat pyrin domain containing protein 1(NLRP1)是白癜风以及白癜风相关的自身免疫性疾病的易感基因。此外,至少有两组独立的突变位点:一组位于NLRP1的基因内,tagSNP rs6502867;而另一组位于NLRP1的启动子区内,tagSNP rs2670660, rs878329, rs7223628, rs8182352, rs4790796, and rs4790797。然而,NLRP1是否也是RA的易感基因目前尚无定论。我们注意到大约25%~30%的广泛性白癜风病人患有至少一种其他类型的自身免疫性疾病,其中包括RA。由此我们提出假设:在汉族人群中,NRLP1相关的突变位点可能与RA的发病风险有关。前期的病例对照研究发现启动子区rs878329与RA的发病具有显著关联性。本文对rs878329进行了初步的功能研究,借以分析该多态性位点是否具有功能活性。研究目的:探讨rs878329对NLRP1转录的影响以及进一步证实该多态性位点的生物学功能。研究方法:提取健康志愿者外周血细胞的基因组DNA,通过TaqMan探针法进行基因分型,再通过荧光定量PCR在不同基因型的外周血细胞样本中检测NLRP1 mRNA的表达,分析不同基因型对NLRP1转录的影响;将构建好的不同单倍型的重组质粒转染入HeLa细胞,通过荧光素酶报告基因实验分析不同单倍型转录调控功能是否具有差异;通过EMSA和Supershift体外分析不同等位的寡核苷酸结合核蛋白的能力。研究结果:(1)不同基因型健康志愿者NLRP1 mRNA表达量存在差异,G/G基因型健康志愿者mRNA相对表达量显著高于C/C基因型健康志愿者(P<0.01,G/C基因型健康志愿者mRNA相对表达量介于两者之间;(2)将不同单倍型的DNA片段克隆至pGL3-Promoter荧光素酶报告基因质粒,采用双荧光素酶报告系统对荧光素酶相对活性进行检测。结果显示,单倍型G的荧光素酶相对活性显著高于单倍型C,但是在含有4个copies片段的重组质粒中,单倍型G和单倍型C的荧光素酶相对活性却没有明显的统计学差异。将不同单倍型重组质粒分别与Runx1真核表达质粒共转染入HeLa细胞后,过量表达Runx1能显著抑制单倍型G的荧光素酶相对活性,而对单倍型C却没有抑制作用;(3)生物学分析(http://www.cbil.upenn.edu/cgi- bin/tess/tess)预测到G等位所在DNA序列是转录因子Runx1的结合位点。因此,分别合成G和C两种等位探针进行EMSA实验。结果显示,G等位探针与核蛋白产生一条结合带,而C等位探针却不能。通过Supershift分析发现当加入了抗Runx1抗体后,G等位探针的泳道中出现一条超滞留结合带,提示G等位探针能够与Runx1发生特异性结合。结论:(1)本研究发现单倍型G能显著增强NLRP1转录活性,使得G/G基因型健康志愿者NLRP1mRNA表达的显著增加。由此推测单倍型G可能通过上调NLRP1的表达增加了RA的易感性;(2)G等位所在DNA序列是转录因子Runx1的结合位点,增加其结合位点或者过量表达Runx1,均能显著降低NLRP1转录活性,由此推测Runx1是针对G等位的一个抑制性转录因子,可能通过下调NLRP1的表达量降低RA的易感性。