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研究背景:CRISPR/Cas9是目前最为应用广泛的基因编辑技术，对CRISPR/Cas9基因编辑在植物中的应用研究有大量的报道，但主要是基因编辑后的鉴定及目的基因的功能，尚未见CAS9蛋白质在植物中表达的研究报道。 研究目的:本研究拟制备CAS9特异的单克隆抗体，利用免疫印迹技术检测转基因水稻中的CAS9蛋白质，了解对转基因稻米中CAS9蛋白质的检测下限，以及CAS9蛋白质在转基因水稻不同时期和不同部位中的表达特征。 材料与方法:Cas9基因全长4131bp，以大肠杆菌重组质粒为模板PCR扩增5端810bp片段，经过EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切目的片段和载体pET30a，将二者连接，转化到大肠杆菌感受态Condon Plus细胞中。用0.5mmol/L的IPTG诱导，在细菌沉淀中获得了重组的CAS9-N蛋白质，分离包涵体，得到纯化蛋白质，免疫小鼠制备抗CAS9单克隆抗体。利用PCR和免疫印迹(WB)技术分别检测了转基因水稻和转基因玉米中的Cas9基因和CAS9蛋白质。将重组CAS9蛋白质和转基因水稻苗期叶片中CAS9蛋白质进行平行免疫印迹检测，利用Image J软件采集信号，绘制标准曲线，对苗期水稻叶片中CAS9蛋白质的含量进行定量分析。提取单粒稻米的总蛋白质，进行不同梯度稀释后，用WB检测单粒转基因稻米中的CAS9蛋白质含量。接下来，用WB检测转基因水稻不同时期、不同部位的蛋白质的表达特征。 结果:通过体外克隆、诱导表达和纯化CAS9-N蛋白质，以纯化的蛋白质作为免疫原免疫小鼠，得到42株杂交瘤细胞株，其中10株检测转基因水稻材料呈阳性反应，从中筛选获得了特异性强和灵敏度高的抗CAS9单克隆抗体（编号＃12D2）。用该抗体检测转基因水稻及重组的CAS9-N蛋白质均呈现特异性目的条带，没有背景信号的干扰。用WB检测转基因水稻和玉米的不同Lines，同时PCR扩增转基因水稻和玉米中Cas9目的片段，结果表明WB与DNA水平的PCR结果相符合。该抗体对其它非转基因植物的检测没有背景干扰。本研究建立的免疫印迹方法对重组CAS9-N蛋白质的检测下限约为0.25ng，在水稻三叶期叶片中，CAS9蛋白质约占鲜重的0.00005％。对单粒转基因大米中CAS9蛋白质的检测下限为8％(约0.2mg)。在水稻苗期，CAS9蛋白质的表达丰度地上部高于地下部，在分蘖期，茎和叶片表达量较高，根和叶鞘表达量低。 结论:体外表达了重组的CAS9-N蛋白质，制备并验证了抗CAS9的单克隆抗体，建立了高灵敏度和高特异性的检测植物中CAS9蛋白质的免疫印迹方法。该方法可检出单粒稻米8％样品中的CAS9蛋白质。发现转基因水稻苗期叶片中CAS9的丰度约为鲜重的0.00005％，在水稻不同组织中CAS9的表达丰度有所不同。预期所建立的方法对转基因植物的检测以及CRISPR/CAS9系统的优化有广泛的应用价值。