金银花叶中黄酮类化合物的提取、纯化及抗氧化研究

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金银花(Lonicera japonica Thunb.)为常见中草药之一,具有抑菌消炎、保肝利胆、清热解毒等功效。金银花种植业会产生大量金银花叶,叶片价钱实惠且采收便利,却被随意丢弃,如果将叶片收集起来提取其中的有效成分,不失为一种充分合理利用自然资源的好方法。金银花叶中富含多种生物活性成分,其中黄酮含量最高。金银花叶黄酮具有较强的抗氧化、抗癌及抑菌等药理功能,因此,对金银花叶资源的研究具有一定的经济效益及社会价值。本文对金银花叶黄酮的提取、纯化和抗氧化进行了研究,实验结论如下:(1)首先研究了超声波辅助乙醇提取金银花叶黄酮的工艺。以总黄酮提取率为指标,在液料比、提取温度、乙醇体积分数和超声功率等单因素实验条件的基础上,经过二次通用旋转组合设计试验优化金银花叶黄酮的超声辅助提取工艺条件。结果表明,在超声功率250W、提取温度46℃、乙醇体积分数60%及液料比65:1(mL/g)的条件下金银花叶黄酮提取率为最大,高达15.67%。(2)对金银花叶黄酮的纯化特性及工艺进行研究。从14种大孔树脂中筛选出NKA-Ⅱ树脂作为最佳吸附树脂,经过静态吸附实验和动态吸附实验得出:NKA-Ⅱ型树脂吸附金银花叶黄酮的过程符合准二级动力学模型;吸附等温线与Freundlich和Langmuir函数拟合程度较高;在上样液质量浓度为2.17 mg/m L、上样液pH为2.82、上样流速1.96 BV/h条件下上柱,以体积分数为75.36%的乙醇4.15 BV在洗脱流速1.47 BV/h的条件下解吸,吸附率可达(97.08±0.49)%,解吸率可达(96.71±0.63)%。纯化后的金银花叶黄酮纯度为78.74%,比粗品黄酮纯度提高了3.24倍。上述纯化工艺可以使NKA-Ⅱ树脂去除金银花叶中的大部分有机酸类物质,更加有效地富集纯化金银花叶中的黄酮类化合物。(3)将纯化所得的金银花叶黄酮进行体外抗氧化活性研究。以Vc为对照品,对比了金银花叶黄酮粗品及纯品的总还原能力,以及清除DPPH自由基、羟自由基(·OH)、超氧阴离子自由基(O2-·)的能力。实验表明:金银花叶黄酮的抗氧化效果较好,纯品的总还原力及对DPPH、·OH、O2-·自由基的清除能力均比粗品强,并且在足够浓度下接近甚至高于Vc对照品。(4)探讨金银花叶黄酮对H2O2诱发RAW264.7巨噬细胞受损的缓解功能。体外培养RAW264.7巨噬细胞,用H2O2诱导损伤该细胞,MTT法测定细胞存活率,并测定不同剂量金银花叶黄酮处理组中细胞和细胞培养液内超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)的活性及丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)的含量。实验数据显示:金银花叶黄酮可缓解H2O2诱发的RAW264.7细胞的受损程度,并呈剂量依赖性,它能够降低H2O2处理后细胞培养液及细胞中的MDA水平,升高SOD、GSH及LDH水平来缓解细胞受损程度。(5)探讨金银花叶黄酮对D-半乳糖诱发衰老小鼠体内血清和各器官衰老氧化受损的缓解程度。小鼠随机分为6组:空白组、模型组、Vc对照组、金银花叶黄酮低、中、高剂量组。各组小鼠(空白组除外)每天颈背部皮下注射D-半乳糖构建衰老小鼠模型,持续注射30 d。同时,对各组衰老小鼠分别以低、中、高剂量组黄酮和Vc溶液进行灌胃。测定小鼠体质量变化和各脏器指数,并测定血清及各器官组织中抗氧化酶等指标。实验数据显示,与空白组对比,模型组小鼠体质量和脏器指数均显著下降,血清和器官中各抗氧化酶及GSH水平均有所降低,MDA水平升高,且大部分差异显著(P<0.05),说明衰老小鼠模型构建成功。与模型组相比,金银花叶黄酮各剂量组小鼠体质量和脏器指数均有所升高,血清和器官中的各抗氧化酶活性及GSH含量均有不同程度的上升,MDA含量下降,其中,金银花叶黄酮高剂量组效果最为显著。可以得出,金银花叶黄酮能有效提高衰老小鼠的抗氧化能力,其抗氧化机制可能与提高机体抗氧化酶活性和还原性保护物质含量,并降低脂质过氧化物含量有关。
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