乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染所致急性或暴发性肝炎、慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）是危及全世界人民健康的重要原因之一。流行病学资料显示，全世界目前有20多亿HBV病毒感染者，其中3.5亿以上患者为慢性感染；慢性感染者中约有40％进展为肝细胞癌，发生率是正常人群的100～200倍。HBV感染对人类健康造成极大的危害，是全世界、尤其是我国亟需解决的重大社会问题和科学问题。不同的个体在感染HBV后，大部分会清除病毒而痊愈；其他人可以发生暴发性肝炎、急性肝炎、无症状携带状态、慢性肝炎、肝硬化、肝癌等不同状态的转归类型。研究者试图建立各种细胞模型和动物模型来模拟人体感染HBV后的各种不同携带状态，并利用这些模型进行相关研究。其中细胞模型的建立和应用已经比较成熟，并被广泛使用。而建立理想的HBV感染动物模型是深入研究HBV所致不同转归的分子机制及筛选有效的抗HBV感染药物必不可少的研究领域。为此，本课题设计建立了HBV感染的急性小鼠模型，与HBV转基因小鼠的耐受模型以及HBV转基因小鼠肝癌形成的天然模型组成一系列HBV不同携带状态的动物模型，系统研究HBV相关肝炎和肝癌发生的分子机制，筛选可阻断疾病进展的关键分子。HBV感染所致肝细胞凋亡不仅是乙型肝炎患者肝细胞损伤、肝功能损害的重要分子机制之一，而且在HBV感染者不同的预后、转归中发挥着非常重要的作用。已有研究表明，TNF-α、FasL等凋亡诱导分子在HBV感染所致肝细胞损伤中发挥重要作用。肿瘤坏死因子凋亡诱导配体（Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）是于1995年被克隆和命名的肿瘤坏死因子家族成员，TRAIL可特异性地诱导肿瘤细胞或者病毒感染细胞凋亡，而对正常组织细胞没有毒性。研究发现，许多因素可改变细胞对TRAIL诱导凋亡的敏感性，主要包括病毒、病毒编码蛋白、放射线、某些药物等。本课题结合前期体外实验研究结果，在国内外率先开展了有关HBV上调TRAIL诱导凋亡机制的动物实验研究，在体内观察HBV感染对TRAIL诱导凋亡敏感性的影响，筛选在TRAIL诱导凋亡通路中的关键分子以及可以有效阻断凋亡通路的关键位点，并利用RNA干扰技术或相应分子的阻断剂从反向证实关键分子和关键位点的作用。利用可溶性DR5阻断TRAIL的作用，观察对于小鼠急性肝炎肝细胞凋亡的影响。HBV转基因小鼠（transgenic mouse）在20个月内100％自然成瘤，能客观模拟HBV携带状态发展成肝癌的全过程，并作为肝癌形成过程中各因素动态变化研究的理想模型。本课题利用基因芯片技术动态研究HBV相关肝癌形成全过程不同时段的肝组织基因表达谱差异；利用蛋白质二维电泳、肽质量指纹图谱等蛋白质组学技术初步筛查不同时段HBV转基因鼠与对照组小鼠肝组织差异表达蛋白。结合基因芯片和蛋白质组学等生物信息学研究结果，从中筛选出HBV相关肝癌形成过程中的关键基因和蛋白，对其表达特点、功能和作用机制进行深入研究。本研究从整体水平揭示了在肝癌发生过程中不同时段的基因和蛋白表达的差异和动态变化，为进一步揭示HBV相关HCC发生的分子机制及HBV相关肝癌生物治疗靶点的确定提供了有力依据。目的1．设计并建立HBV转基因小鼠过继转输HBV特异性CTL诱导的小鼠肝炎模型和尾静脉高压注射法制备的高表达HBsAg的乙型病毒性肝炎小鼠模型，以此为平台研究TRAIL诱导的细胞凋亡在HBV感染所致相关疾病中的作用和机制。2．以上述建立的小鼠模型为研究对象，观察HBV对TRAIL诱导肝细胞凋亡的影响，从胞膜受体水平、胞浆通路水平及线粒体依赖和线粒体非依赖途径，探讨HBV影响TRAIL诱导凋亡的分子机制，并进一步验证关键分子的作用。3．以上述动物模型作为研究对象，利用可溶性死亡受体5蛋白（sDR5）特异性封闭TRAIL诱导的凋亡通路，研究sDR5对肝炎的治疗作用。4．以HBV转基因小鼠作为肝癌形成的天然模型，采用基因组学和蛋白质组学技术，动态观察和分析HBV转基因鼠与对照组小鼠基因组和蛋白质组表达差异，为进一步揭示HBV相关HCC发生的分子机制，发现新的肿瘤相关抗原，指导其预防和治疗提供有力依据。方法1．新型急性乙型肝炎小鼠模型的建立与评价1．1 HBV转基因小鼠过继转输HBV特异性CTL建立急性肝炎模型构建HBV全基因真核细胞表达载体，免疫BALB／c小鼠，诱导产生HBV特异性CTL，分离脾细胞过继转输给同系HBV转基因小鼠。48小时后处死HBV转基因小鼠，检测肝功能、肝组织病理变化，进行模型鉴定。1．2尾静脉高压注射法建立急性乙型肝炎小鼠模型利用小鼠尾静脉高压注射法，将重组质粒pcDNA3／1.1HBV注射BALB／c小鼠，制备急性乙型病毒性肝炎小鼠模型。体内转染后不同时段检测小鼠血清谷丙转氨酶、乙肝表面抗原、e抗原及相应抗体，实时定量PCR检测HBV DNA，肝组织病理切片检查等进行模型鉴定。2．HBV致小鼠模型肝细胞凋亡过程中TRAIL凋亡通路关键分子Bax的作用2．1 TRAIL凋亡通路分子的测定及关键分子Bax的确定分别从胞外和胞内两个水平进行研究：半定量逆转录聚合酶链反应检测小鼠急性肝炎模型建立前后细胞表面TRAIL受体DR5、DcR1、DcR2的表达。Western blot检测Caspase3、Caspase8、Caspase9的活化及Bax的表达。2．2 TRAIL凋亡通路关键分子Bax的功能验证利用RNA干扰进行基因沉默，验证Bax在HBV感染所致TRAIL诱导凋亡失衡中的变化和作用。3．利用sDR5蛋白阻断TRAIL凋亡通路减轻小鼠模型肝脏炎症损伤3．1 sDR5蛋白的制备、纯化与生物学活性研究大量扩增可溶性DR5酵母表达载体转化阳性的毕赤酵母GS115菌株，收集上清，利用ProBond^TM亲和层析柱纯化获得重组sDR5蛋白，用SDS—PAGE、Western Blot检验纯化产物的特异性和纯度。用MTT法检测纯化的sDR5蛋白对TRAIL诱导人宫颈癌细胞系Hela细胞凋亡作用的阻断效应。3．2利用sDR5蛋白封闭TRAIL凋亡通路减轻小鼠模型急性肝炎将sDR5蛋白应用于过继转输HBV特异性CTL和尾静脉高压注射法建立的小鼠急性乙型肝炎模型中，观察TRAIL调亡通路被特异性封闭后对所建立的乙肝炎症模型和肝功能相关指标，以及肝细胞凋亡水平的影响。确定sDR5作用的最佳时间和剂量。3．3 sDR5与SNMC（美能）疗效比较使用实验确定的sDR5的最佳作用时间和剂量，与临床常用保肝药物SNMC（美能）的作用效果进行比较。4．HBV转基因小鼠肝癌形成模型的动态生物信息学研究4．1 HBV转基因小鼠肝癌形成模型的鉴定分别取6、12、20个月（早、中、晚三个时间段）的HBV转基因小鼠的肝脏组织，病理切片观察肝肿瘤结节的形成，检测不同时段各观测指标的变化。4．2利用基因芯片进行基因表达谱差异研究提取各组小鼠肝组织总RNA，以小鼠基因芯片（35，000个基因）动态研究HBV相关肝癌形成全过程不同时段的肝组织基因表达谱差异。利用生物信息学软件分析得到有意义的差异表达基因。4．3肝癌形成动态过程的蛋白质组学研究通过蛋白质二维电泳、MOLDI-TOF-MS和肽质量指纹图谱（PMF）等方法比较HBV转基因小鼠与对照组小鼠肝组织蛋白质在不同时段表达的差异。2-DE、质谱分析和生物信息学构成了蛋白质组学研究的完整流程：1)蛋白质样品制备与定量；2)双向凝胶电泳；3)凝胶图像扫描与分析；4)MOLDI-TOF-MS获得PMF；5)SWISS-2DPAGE数据库检索；6)Mascot数据库检索确定质谱分析获得的结果。利用RT-PCR、荧光定量PCR技术、Western blot技术等验证差异基因或蛋白质的表达变化是否与芯片结果相一致。利用基因转染或RNA干扰技术进行体外或体内功能研究。结果1．新型急性乙型肝炎小鼠模型的建立与评价1．1 HBV转基因小鼠过继转输HBV特异性CTL建立急性肝炎模型转基因鼠尾静脉注射免疫鼠脾脏淋巴细胞后，血清蛋白水平无明显变化，转氨酶ALT、AST显著升高，明显超出正常值范围，肝组织出现弥漫性变性，肝细胞肿胀成球形（气球样变）、胞浆疏松化，肝细胞呈嗜酸性变，出现嗜酸性小体，汇管区炎症细胞浸润明显，肝损伤的程度为（++），肾脏无明显损伤，表成功建立了携载HBV的小鼠急性肝炎模型。1．2尾静脉高压注射法建立急性乙型肝炎小鼠模型成功制备了高表达HBsAg的乙型病毒性肝炎小鼠模型，小鼠血清ALT在8小时达到810±138u；主要表达HBsAg；血清中检测到HBV DNA；肝脏组织切片显示病毒性肝炎病理改变。经血清谷丙转氨酶、乙肝表面抗原、e抗原测定，实时定量PCR检测HBV DNA以及肝脏病理证实小鼠肝炎模型建立成功。2．HBV致小鼠模型肝细胞凋亡过程中TRAIL凋亡通路关键分子Bax的作用2．1 TRAIL凋亡通路分子的测定及关键分子Bax的确定半定量逆转录聚合酶链反应检测小鼠急性肝炎模型建立前后细胞表面TRAIL受体DR5、DcR1、DcR2的表达，均无显著性差异。Western blot检测Caspase3、Caspase8、Caspase9的活化及Bax的表达。在HBV转基因小鼠肝细胞中检测到较对照组小鼠肝细胞表达更高水平的Bax蛋白，以及Caspase的相应变化。2．2 TRAIL凋亡通路关键分子Bax的功能验证应用小干扰RNA技术特异性封闭HBV转基因小鼠肝细胞中Bax基因的表达后可显著减轻过继转输HBV特异性CTL所引起的急性肝脏炎症反应，降低肝细胞凋亡率，以及凋亡通路分子Caspase-3，8，9和Bid的活化水平，从而进一步验证了Bax分子在HBV影响TRAIL诱导凋亡中的关键性作用。3．利用sDR5蛋白阻断TRAIL凋亡通路减轻小鼠模型肝脏炎症损伤3．1 sDR5蛋白的制备、纯化与生物学活性研究结果显示，转化阳性的毕赤酵母GS115菌株可成功表达分子量为26kD的sDR5蛋白，经ProBond^TM亲和层析柱纯化，SDS—PAGE、Western Blot鉴定，获得了高纯度的重组人可溶性DR5，蛋白产量达20μg／ml；体外活性检测结果显示纯化的sDR5蛋白可部分阻断TRAIL诱导的Hela细胞的凋亡。证实经纯化后的重组人sDR5蛋白可有效阻断TRAIL诱导的细胞凋亡反应。3．2利用sDR5蛋白封闭TRAIL凋亡通路减轻小鼠急性肝炎将sDR5蛋白提前腹腔注射，可明显减轻小鼠急性乙型肝炎模型肝脏损伤程度，检测肝细胞凋亡率，结果与肝脏损伤程度的变化一致。研究确定了提前24小时应用为最佳作用时间，16mg／kg为最低有效作用剂量。3．3 sDR5与SNMC（美能）疗效比较sDR5的保肝作用与目前临床使用的保肝药物——SNMC效果相当，作为自主知识产权的保肝药物进行开发具有良好的应用前景和市场开发潜力。4．HBV转基因小鼠肝癌形成模型的动态生物信息学研究4．1 HBV转基因小鼠肝癌形成模型的鉴定经过大体解剖和病理切片观察，证实HBV转基因小鼠在20个月可以发生肝癌，发生比例在95％以上。而HBV在小鼠体内持续存在，其复制和表达水平维持在稳定的水平。4．2利用基因芯片进行基因表达谱差异研究随着转基因小鼠月龄的增长，差异表达基因数目逐渐增加，其中表达上调基因数目和表达下调数目的变化趋势与总的基因数目变化相同。将这些差异基因进行功能注释发现主要与细胞生长与稳定、蛋白质代谢、核酸代谢、应激、信号转导、免疫应答、细胞凋亡、细胞黏附等生物过程有关。我们发现补体调节蛋白Cfh，Cfi，Cd59a，Mb12等在肝癌形成过程中表达下调，已经利用RT-PCR技术进行了验证。进一步对一些表达下调基因进行了相关microRNA检索分析，发现let-7，miR-122a，miR-214，miR-133，miR-370，miR-34等可能对Thrsp，Cyp17a1，Dbp，C4，Ugtlal，Tef，Cfi，Tnfaip9，Cfh，Tde1，Mb12等靶基因表达具有调节作用。已经对补体成分的变化进行了RT-PCR验证，得到了与芯片相一致的结果。另外还要对肿瘤发生、免疫、凋亡等相关基因和蛋白的变化进行验证和功能研究。4．3肝癌形成动态过程的蛋白质组学研究通过PDQuest软件搜寻和数据统计分析，三组小鼠中表达差异的蛋白质数目分别为：6个月上调15±6，下调18±6；12个月上调17±5，下调20±8；20个月上调25±12，下调23±13。已经从凝胶上选取了126个点进行MOLDI-TOF-MS检测，对获得的肽质量指纹图谱进行了Mascot数据库检索和分析，确定了其中部分点的蛋白质种类和主要功能。结论1．设计并成功建立了HBV转基因鼠过继免疫诱导的小鼠肝炎模型及尾静脉高压注射法制备的高表达HBsAg的乙型病毒性肝炎小鼠模型，以此为模型探索了体内TRAIL在HBV感染所致炎症中的效应和作用机制，该模型为进一步深入研究乙型肝炎发病机制及相关药物开发提供了良好的实验体系。2．研究发现TRAIL在HBV感染所致细胞凋亡增加中起重要作用，从TRAIL凋亡通路的胞膜受体水平、胞浆凋亡通路水平及线粒体依赖途径和线粒体非依赖途径，深入探讨了HBV影响TRAIL诱导凋亡的分子机制。首次发现HBV可提高Bax蛋白的表达水平，在HBV增强TRAIL诱导凋亡中发挥关键性的作用，为深入阐明HBV的致病机制和探索新的有效的治疗靶位提出了新思路。利用小干扰RNA技术封闭小鼠肝细胞中Bax基因的表达，从反向进一步证实Bax蛋白的表达上调在HBV感染所致肝细胞凋亡中发挥关键性作用，同时针对Bax基因的小干扰RNA载体可显著减轻肝脏炎症反应和病理损伤程度，可作为一种保肝药物开发利用。3．成功制备、纯化可溶性DR5蛋白（sDR5），利用获得的sDR5蛋白在小鼠乙型肝炎模型中验证了TRAIL在乙型病毒性肝炎的发生中发挥了重要作用，并且sDR5蛋白的应用可显著减轻肝脏炎症反应和病理损伤程度，其保肝效果与目前临床使用的保肝药物——美能（SNMC）相当，因此sDR5蛋白作为一种保肝药物在乙型病毒性肝炎，尤其是急性暴发型乙型肝炎的治疗中具有良好的应用前景和市场开发潜能。4．结合基因芯片和蛋白质组学技术，对肝癌形成过程中关键分子的变化进行动态观察和分析，以进一步阐明HBV相关HCC发生的分子机制，确定HBV相关肝癌生物冶疗的新靶点。意义1．课题所制备两种肝炎动物模型，制备相对简便、效果明显，具有良好的实验室推广价值，可用于HBV相关机制研究和药物开发研究。2．本研究发现HBV感染可提高Bax蛋白的表达水平，利用小干扰RNA技术从反向进一步证实Bax蛋白的表达上调在HBV感染所致肝细胞凋亡中发挥关键性作用，同时针对Bax基因的小干扰RNA载体可显著减轻肝脏炎症反应和病理损伤程度，可作为一种保肝药物开发利用，具有良好的推广价值。3．动物实验研究表明，TRAIL的阻断剂sDR5具有很好的阻断效果，为特异性阻断TRAIL诱导的凋亡通路提了良好的生物材料，对于多种炎症性疾病的治疗具有潜在开发应用价值。4．本研究首次提出利用HBV转基因小鼠肝癌模型探讨HBV相关肝癌发生的分子机制。结合基因芯片和蛋白质组学等生物信息学技术，对肝癌形成过程中关键分子的变化进行动态观察和分析，以进一步阐明肝癌发生的分子机制，有利于早期诊断和预防，找到HBV相关肝癌生物治疗的新靶点。