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烟碱是烟草特有的、根系合成的次生代谢产物。已有研究表明,烟株打顶增强了根系烟碱合成能力。本实验室前期的研究显示,打顶后烟碱合成能力增强的主要原因是由于去除顶端分生组织及相邻幼嫩叶,破坏了原有的内源激素(IAA)平衡,导致烟碱的合成部位——侧根发育增强,同时打顶伤害刺激会诱导产生JA信号物质增强烟碱合成的能力。本实验室从烟株打顶前后SSH差异表达文库和DGE中筛选出一些相关信号传递的CDS序列,为进一步研究烟株打顶伤害诱导根系烟碱生物合成的分子机理奠定了基础。本研究以NtWRKY-R1为切入点分析其对IAA和JA信号的响应。结果如下:1.对去除顶端分生组织和相邻幼嫩叶片后的DR5::GUS转基因拟南芥根系进行GUS组织化学染色,分析结果显示:随着打顶时间推移,根尖组织蓝色逐渐加深,表明植物打顶后会导致根尖分生组织IAA合成增大,促使根系的进一步发育。2.采用Genome walking技术扩增出NtWRKY-R1的启动子序列,并采用PlantCARE databases在线预测,结果显示NtWRKY-R1的启动子序列中含有多种顺式作用元件,其中包含AuxRR和GARE-motif。推测NtWRKY-R1可能参与烟株打顶产生的IAA和JA信号途径。3.构建了NtWRKY-R 部分删除启动子与GUS基因的融合表达载体:NtWRKY-R1-386UTR117::GUS、-793UTR117::GUS、-1387UTR117::GUS、-1803UTR117::GUS和35S::GUS对照载体,分别成功转化入BY-2细胞,获得了稳定遗传细胞系。并将-1387UTR117::GUS成功转入烟草植株。4.检测转化有NtWRKY-R1启动子::GUS融合表达的BY-2细胞中GUS活性,确定最佳反应测定时间为30min;分别采用不同浓度2,4-D和MeJA处理转基因BY2细胞后,检测GUS活性,确定2,4-D最佳浓度为0.5μm,MeJA最佳浓度为25μm;以0.5μm 2,4-D处理启动子-386UTTR117::GUS和-1387UTR117::GUS两个细胞系,检测不同时间GUS活性变化,结果显示24h活性分别达到对照的3.8倍和3倍,以25μm MeJA处理启动子-1387UTR117::GUS细胞系,检测不同时间GUS活性变化,结果显示48h活性达到对照的2倍;同时加入0.5μm2,4-D和25μmMeJA处理启动子-1387UTR117::GUS株系,检测24h GUS活性结果显示,相对于单独2,4-D处理下降了 50%,相对于单独MeJA处理下降了 30%,表明烟株打顶伤害信号向根系传递过程存在IAA和JA互作。5.对启动子-1387UTR117::GUS转基因烟草分别进行0.5μm 2,4-D和25μmMeJA处理,24h后检测GUS活性,结果显示:与处理转基因BY-2有相同的变化趋势,与对照相比,0.5μm 2,4-D处理后GUS活性上升3倍,25μm MeJA处理后上升2.8倍;同时加入0.5μm 2,4-D和25μm MeJA处理-1387UTR117::GUS株系,相对于单独2,4-D处理下降了 25%,相对于单独MeJA处理下降了 20%。综上表明NtWRKY-R1参与了 JA和IAA互作介导的地上部打顶伤害刺激对根系烟碱合成能力的信号传导。6.采用NtWRKY-R1多克隆抗体和丝氨酸磷酸化抗体对打顶前后根尖组织NtWRKY-R1转录因子进行Western Blot分析,结果显示:打顶后烟株根尖组织中磷酸化修饰的NtWRKY-R1蛋白增加。表明打顶会增加磷酸化状态的NtWRKY-R1蛋白进而参与下游基因调控。NtWRKY-R1对JA信号和IAA信号的响应有交互作用,且对JA信号的响应明显强于IAA信号,在响应过程中伴随有磷酸化修饰。综合结果表明NtWRKY-R1是根系响应地上部打顶伤害信号一个组分。