中国卤虫AS-NUPR1蛋白在发育和高盐胁迫过程中的表达

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中国卤虫(Artemia sinica)是一类生活于高盐水体中的小型甲壳类动物,对于环境有着极强的适应能力,能够抵御许多生物无法适应的高盐与低温的极端不利条件。As-NUPR1是一种应激相关蛋白,在中国卤虫滞育期的胚胎发育方面起着重要作用,并有着复杂多样的细胞功能。但对于中国卤虫As-NUPR1在卤虫发育各时期及盐胁迫条件下的表达模式的研究尚未见报道。  本研究采用分子克隆技术得到了中国卤虫As-nupr1198bp的开放阅读框序列片段。生物信息学分析结果显示,As-nupr1的ORF编码了66个氨基酸,分子量为7.9kD,理论等电点为10.34。As-NUPR1蛋白包括了一个phospho-p8结构域,这是NUPR1蛋白的标志性结构域。系统发育进化树分析显示中国卤虫As-NUPR1与无脊椎动物NUPR1的相似性要比与脊椎动物NUPR1高,进化关系也与实际相符。  利用原核表达方法成功地从中国卤虫的cDNA序列中表达出As-NUPR1蛋白。重组蛋白包含了132个氨基酸,分子量为15kDa,理论等电点为7.17。该重组蛋白为可溶性蛋白。利用组氨酸亲和层析法进行蛋白纯化。以此纯化蛋白作为抗原,免疫Balb/c小鼠制备出As-NUPR1多克隆抗体,并进行后续的免疫相关研究。  通过免疫组化的实验技术检测了As-NUPR1在胚胎发育不同时期的空间表达模式,结果显示,在中国卤虫发育的不同时期,As-NUPR1在各个组织结构中都有广泛的表达。  以免疫印迹方法检测As-NUPR1在胚胎发育不同时期及盐胁迫条件下的表达模式时发现,As-NUPR1在卤虫胚胎滞育刚刚结束阶段的表达出现了逐步下调趋势,而在卤虫破壳而出后表现出上升趋势。另外,在高盐度胁迫下As-NUPR1表达量也显著上升。这些结果都表明As-NUPR1是一类应激相关蛋白,它在胚胎发育不同时期,尤其是滞育期,在保护胚胎免受高盐伤害方面起到作用。
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