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脂肪代谢与动物生产及人体健康密切相关,肝脏作为脂肪代谢的重要器官,对脂质代谢起到关键调控作用。在动物生产中,肝脏脂肪过度积累会导致脂肪肝综合征,损害动物健康、降低养殖效益。在人体中,肝脏脂肪过度堆积导致脂肪肝、糖尿病等代谢性疾病。同时,线粒体作为细胞能量代谢中心,对脂肪代谢的重要性不言而喻。近期研究表明,线粒体钙稳态影响机体脂质代谢,但其作用机制尚不明确,因此我们对线粒体钙稳态与肝脏脂肪代谢关系进行了研究。本课题以HepG2人肝癌细胞、AML12小鼠肝实质细胞、LMH鸡肝癌细胞为细胞模型,以C57BL/6小鼠、黄羽肉鸡为动物模型,在体内及体外进行高脂诱导,并利用腺相关病毒、基因敲除、MCU过表达载体、RNAi、ER-Mito Linker载体、MICU1突变载体、透射电镜、MCU抑制剂等技术,对线粒体钙稳态的关键—线粒体钙离子单向转运蛋白（Mitochondrial Calcium Uniporter,MCU）进行研究,探索线粒体钙稳态对脂肪代谢的调控机制,为脂肪肝治疗提供理论依据及可行方案。获得如下实验结果:1.MCU影响线粒体钙稳态并调节肝细胞脂质积累利用HepG2细胞,在体外建立油酸/棕榈酸（OA/PA）诱导的高脂模型,发现高脂诱导肝细胞线粒体钙过载。利用MCU载体及si RNA对MCU进行过表达或抑制,同时进行高脂诱导,发现过表达MCU使线粒体钙升高,脂肪沉积增多;抑制MCU使线粒体钙水平降低,脂质积累减少。MCU还影响脂肪酸合成酶（FAS）及脂肪酶（Lipase）活性,并促进活性氧（ROS）产生,提示MCU可能通过调节氧化应激及脂肪代谢酶活性以控制肝细胞脂肪代谢。以AML12细胞为模型的实验中,同样发现上述现象,进一步证明MCU对肝细胞脂质代谢的调控作用。2.抑制肝脏MCU缓解肝脏脂肪变性为验证MCU在体内的作用,以小鼠为动物模型,利用腺相关病毒抑制肝脏MCU,并进行高脂饮食诱导。结果表明抑制MCU增强小鼠葡萄糖耐量、降低脂肪率、缓解附睾脂肪细胞肥大及肝脏脂肪变性。通过将MCU敲除鼠MCUfl/fl与肝脏特异性Cre重组酶转基因小鼠杂交产生肝脏MCU敲除鼠,敲除小鼠肝脏中MCU后进行高脂饮食诱导,结果发现肝脏MCU+/-小鼠脂肪率显著降低;脂肪细胞肥大受到明显抑制;葡萄糖耐量增强;同时肝脏的脂肪变性得到有效缓解。3.高脂诱导的肝细胞线粒体钙过载机制研究以HepG2细胞为模型,探究高脂条件下,肝细胞的线粒体钙过载机制。高脂促进肝脏线粒体相关膜（MAM）形成,使用内质网-线粒体Linker载体（ER-Mito-Linker）模拟MAM后,会使细胞线粒体钙过载并导致甘油三酯增多;利用RNAi技术对MAM形成中的关键基因PACS2及IP3R2进行抑制可以缓解线粒体钙过载,并降低脂肪沉积;证明高脂诱导的MAM形成是导致线粒体钙过载及脂肪沉积的原因。为探究MCU通道在高脂条件下的开放及闭合机制,对MCU通道复合物EMRE、MICU1及MICU2进行过表达或者抑制。结果发现,只有MICU1对肝细胞脂质沉积有影响;更有趣的是,在正常情况下,过表达MICU1可以降低线粒体钙水平;而在高脂条件下,过表达MICU1不影响线粒体钙水平;证明高脂影响MICU1对线粒体钙稳态的调控。MICU1控制MCU通道开关,当MICU1处于高浓度Ca2+环境时,MICU1手性区域与Ca2+结合,使MCU通道持续开放。为验证此理论,我们对MICU1与Ca2+结合的手性区域进行突变并将其转染进肝细胞,结果表明,在高脂条件下,MICU1不能降低线粒体钙水平,而MICU1突变体阻止了线粒体钙过载,同时还缓解了脂肪沉积。综上,高脂促进肝脏MAM形成,MAM通过IP3R释放内质网中Ca2+,使MICU1处于高Ca2+环境,与Ca2+结合的MICU1不能关闭MCU通道,使MCU通道持续开放,导致线粒体钙过载,脂肪积累增多。4.MCU抑制剂缓解小鼠肝脏脂肪变性使用Discovery Studio对MCU及其抑制剂米托蒽醌进行分子模拟对接后发现,米托蒽醌通过与MCU两个关键残基Glu264和Asp261相互作用,阻止Ca2+通过MCU。在肝细胞中利用两种MCU抑制剂（Ru360和米托蒽醌）对MCU进行抑制,结果表明,两种抑制剂均可降低肝细胞线粒体钙水平,缓解高脂诱导的肝细胞氧气消耗率降低,并降低脂肪积累。在建立小鼠高脂模型时,利用Ru360及米托蒽醌对小鼠进行为期八周的腹腔注射。结果表明,二者均显著缓解了高脂饮食诱导的小鼠脂肪率升高、脂肪细胞肥大,并使葡萄糖耐量增强,缓解了肝脏脂肪变性,增强脂肪酸β氧化关键酶—酯酰辅酶A脱氢酶活性,提示MCU抑制剂可能通过促进肝脏脂肪酸氧化而降低脂质积累。5.MCU抑制剂缓解鸡肝脏脂肪变性为探寻动物生产中脂肪肝治疗方法,我们利用米托蒽醌对LMH鸡肝细胞及黄羽肉鸡进行处理。在LMH鸡肝细胞中,发现米托蒽醌可以缓解高脂诱导的线粒体钙过载、脂质积累增多。利用黄羽肉鸡,建立高脂饮食诱导的肝脏脂肪变性模型,同时为其注射米托蒽醌。结果发现,高脂饮食诱导鸡的肝脏肥大,米托蒽醌则可缓解鸡肝肥大;高脂饮食还诱导鸡肝脏脂肪沉积,而米托蒽醌可以缓解肝脏脂肪积累,证实米托蒽醌可以治疗鸡脂肪肝综合征。综上,MCU可以调控肝脏脂肪代谢,抑制或敲低肝脏MCU可以缓解高脂诱导的小鼠肝脏脂肪变性。高脂饮食诱发肝脏MAM形成,MAM产生的高Ca2+环境使MICU1功能失调,导致线粒体钙过载,使ROS升高、脂肪酶活性降低、脂肪酸β氧化降低,而MCU抑制剂可以缓解高脂诱导的肝细胞、小鼠和鸡肝脏脂肪变性。这为研究动物及人脂肪肝的形成机制提供了新的思路,为脂肪肝的治疗发现了新的方法,为后续的药物开发奠定了基础。