论文部分内容阅读
目的： 1.研究CYP2781转基因小鼠腰椎间盘退变的机制。 2.研究益气化瘀补肾方，高钙高磷高乳糖干预CYP27B1转基因小鼠腰椎间盘退变的作用效果和作用机理。 方法： 1.CYP27B1转基因小鼠腰椎间盘退变机制研究 通过杂交繁殖和基因表型鉴定，获得16周龄CYP2781转基因小鼠的纯合子(CYP27B1-/-)6只，杂合子(CYP27B1+/-)6只和野生型小鼠(CYP27B1+/+)6只。取16周龄纯合子，杂合子和野生型小鼠的腰椎(腰4～6)，分别进行大体形态学HE染色，腰椎间盘软骨细胞藏红固绿染色，腰椎间盘软骨细胞甲苯胺兰染色，腰椎间盘破骨细胞酸性磷酸酶(TRAP)染色，腰椎间盘(RUNX2，AXIN2，Cathepsin K，COLI，COLX，MMP13，osteocalcin)免疫组织化学染色。实时定量PCR检测杂合子小鼠腰椎间盘骨化三醇合成相关基因CYP24al，CYP27al。CYP27bl，正常软骨细胞相关基因COL2al，SOX9，OPG，破骨细胞相关基因TRAP，Cathepsin K，TNF-α，MMP13，肥大软骨细胞相关基因COL10al，HIF-2α，成骨细胞相关基因BMP7，β-catenin表达；实时定量PCR检测纯合子小鼠腰椎间盘正常软骨细胞相关基因Aggrecan，COL2al，SOX9，OPG，成骨细胞相关基因ALP，肥大软骨细胞相关基因COL10al，凋亡相关基因Cathepsin K，β-catenin信号通路相关基因PTH，WNT3A，WNT-1，β-catenin，MMP7表达。Micro-CT扫描检测第4腰椎体骨量并构建三维形态。 2.益气化瘀补肾方，高钙磷乳糖延缓CYP27B1转基因小鼠腰椎间盘退变机制研究 24周龄CYP27B1转基因小鼠纯合子(CYP2781-/-)40只随机分为模型组、益气化瘀补肾方组、高钙高磷高乳糖组、骨化三醇组，每组10只；24周龄CYP27B1转基因小鼠杂合子(CYP27B1+/-)40只随机分为模型组、益气化瘀补肾方组、高钙高磷高乳糖组、骨化三醇组，每组10只；24周龄野生型小鼠(CYP2781+/+)10只作为正常对照组。给药干预4周后，取下各组小鼠的腰椎(腰4～6)，分别进行大体形态学HE染色，腰椎间盘软骨细胞藏红固绿染色，腰椎间盘软骨细胞甲苯胺兰染色，腰椎间盘破骨细胞酸性磷酸酶(TRAP)染色，腰椎间盘(VEGF，β-catenin，COLX，MMP7，MMP13)免疫组织化学染色，实时定量PCR检测各干预组杂合子小鼠腰椎间盘ALP，COL1al，COL2al，Aggrecan，COL10a1，IL-1β基因表达；实时定量PCR检测各干预组纯合子小鼠腰椎间盘Aggrecan，ALP，Cathepsin K，COL1al，osteocalcin基因表达。Micro-CT扫描检测第4腰椎体骨量并构建三维形态。 结果： 1.CYP27B1转基因小鼠腰椎间盘退变研究 杂合子小鼠腰椎间盘退变主要表现软骨终板存在骨髓样空洞和破骨细胞。骨髓样空洞局部RUNX2，AXIN2，CathepsinK，COLI，COLX，MMP13，osteocalcin蛋白表达与野生型小鼠相比增加。实时定量PCR结果发现与野生型小鼠相比，杂合子小鼠腰椎间盘骨化三醇合成相关基因CYP27B1表达增高上调，正常软骨细胞功能相关基因COL2al，SOX9，OPG表达下调，破骨细胞相关基因Cathepsin K，TRAP，TNF-α，MMP13表达下调，肥大软骨细胞相关基因HIF-2α，COL10al表达上调，成骨细胞相关基因BMP7，β-catenin表达上调。杂合子小鼠腰椎体骨量略微下调。 纯合子小鼠腰椎间盘退变表现软骨细胞生长板增厚；肥大软骨细胞分布广泛。与野生型小鼠相比，腰椎间盘纤维环AXIN2，COLI，COLX蛋白表达增加，髓核RUNX2，AXIN2，Cathepsin K，COLI，COLX，osteocalcin蛋白表达增加；实时定量PCR结果发现与野生型小鼠相比，纯合子小鼠腰椎间盘正常软骨细胞功能相关基因Aggrecan，COL2al，OPG，SOX9表达下调，成骨细胞相关基因ALP表达下调，肥大软骨细胞相关基因COL10al表达上调，软骨细胞凋亡相关基因Cathepsin K表达下调，信号通路相关基因PTH表达上调，WNT3A，WNT-1，表达明显下调，β-catenin，MMP7表达略微下调。纯合子小鼠腰椎体骨量明显减少。 2.益气化瘀补肾方，高钙磷乳糖延缓CYP2781转基因小鼠椎间盘退变机制研究 益气化瘀补肾方延缓杂合子小鼠腰椎间盘退变：抑制软骨终板空洞骨化，抑制破骨细胞活化。实时定量PCR结果显示益气化瘀补肾方上调杂合子小鼠腰椎间盘Col2αl基因表达。 益气化瘀补肾方延缓纯合子小鼠腰椎间盘退变：明显改善纯合子小鼠腰椎间盘软骨细胞功能，藏红和甲苯胺兰着色增加，COLX蛋白免疫组织化学染色减淡。益气化瘀补肾方未能增加纯合子小鼠腰椎体骨量。 高钙高磷高乳糖延缓杂合子小鼠腰椎间盘退变：改善了腰椎间盘软骨细胞功能，但是未能抑制软骨终板空洞骨化。实时定量PCR结果显示高钙高磷高乳糖下调杂合子小鼠腰椎间盘ALP，COL1al，COL10al，IL-1β基因的表达。 高钙高磷高乳糖延缓纯合子小鼠腰椎间盘退变：改善腰椎间盘软骨细胞功能和腰椎间盘结构，明显增加纯合子小鼠腰椎体骨量。实时定量PCR结果显示高钙高磷高乳糖上调腰椎间盘cathepsin K，ALP，COL1al，osteocalcin基因表达。 结论： 腰椎间盘旁分泌骨化三醇激活破骨细胞是杂合子小鼠腰椎间盘退变机制。低血磷抑制肥大软骨细胞凋亡，甲状旁腺素表达增高激活β-catenin信号通路是纯合子小鼠腰椎间盘退变机制。高钙高磷高乳糖与益气化瘀补肾方能够改善CYP2781转基因小鼠腰椎间盘软骨细胞功能；前者可以改善纯合子小鼠腰椎间盘结构，抑制纯合子小鼠椎体骨质疏松表现。益气化瘀补肾方延缓CYP2781转基因小鼠腰椎间盘退变的干预效果通过以药测证的方法验证CYP2781转基因小鼠体内存在气虚血瘀肾亏证候。