第一部分：成年大鼠海马CA1区锥体神经元外向整流氯离子单通道特性 Cl~-是生物体内含量最多的阴离子，氯通道参与了跨细胞膜和细胞器膜Cl~-的转运。氯通道种类众多，分布广泛，参与了细胞多项生理功能的调控，如调节细胞兴奋性、跨上皮细胞膜物质转运、细胞容积和细胞内pH调控等。目前有三类已知基因并克隆表达的氯离子通道：ClC氯通道(ClC-1～ClC-7，ClC-K1和ClC-K2)、配体门控氯通道(GABA和甘氨酸受体)和囊性纤维变性调节因子氯通道(CFTR)。外向整流氯离了通道(outwardly rectifying chloride channels，ORCC)是一类中电导氯通道，分子结构目前仍然不清楚，但是其广泛分布于上皮细胞、神经胶质细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、心肌细胞等多种组织细胞。在神经系统，Strupp等人发现在人和大鼠的神经轴突有外向整流特性的氯通道，Lascola发现新生大鼠皮层胶质细胞存在ORCC。近来研究发现：ClC-3作为ORCC的候选基因，大量分布于海马区、嗅球和小脑。但是，对成年大鼠中枢神经系统ORCC，目前尚无研究。 除了磷酸化作用，氧化还原亦参与通道功能的调控过程。在某些病理情况下，如可引起成年大鼠海马CA1区锥体神经元出现凋亡的短暂性前脑缺血，神经元内的氧化还原状态会发生明显改变，并影响通道的功能活动。要阐明氯通道在缺血后海马CA1锥体神经元凋亡中的作用，有必要首先对这些神经元的外向整流氯离子通道有较清楚的认识。为此，本文观察了在成年大鼠海马CA1区锥体神经元上是否有外向整流氯离子通道，并对其单通道特性进行了系统的研究。 1 材料和方法山西医科大学20仍博士学位论文 1.!脑片的制备与神经元的急性分离 按我们以往报道的方法进行神经细胞的急性分离。实验采用成年雄性wistar大鼠(1 80一2509)，麻醉后(水合氯醛40 mg八009)迅速断头取脑，用振动切片机切成400林m厚的脑片。将切好的脑片置于通以95%()z巧%CO:混合气的EBSS液中孵育l一6小时，然后分离海一马C八!区红l织井放入少}J 100%O:饱和的HBsS液中片J链已l蛋户I酶(protease xlV，!.!一1.4 mg/ml)消化30一45分钟，控制温度为33℃，置于低ca2+的羚乙基磺酸钠缓冲液中吹打成细胞悬液备用，实验选用形态饱满的锥形或梭形、有顶树突和基树突特征的锥体细胞进行记录。2单通道电流记录与数据分析 公巧验采川I勺I{川;.j外J弋)I莫)llt乍1讨支术，l匕极中jl‘}!.为8一12M‘2‘，’}‘，.通j返电流经)J莫片钳放大器(Axopateh ZooB)由A/o转换系统(oigidata 1 320)以5 kHz频率采集，低通滤波为1 kHz。数据采集、分析使用pClamp 8.0、SpSS 1 0.0和Origin7.0软件。测量通道开关事件的时间分辨率为300卜s，通道的开放概率指通道总开放时间占总记录时间的百分比。单通道的电流一电压关系曲线由二次方程式拟和，单通道电导由一定范围内做线性回归得到。实验记录时环境温度为20一22℃。 1.3溶液和试剂 轻乙基磺酸钠缓冲液成份为(mmol/L):轻乙基磺酸钠140，KC12，MgC124，CaC12 0.1，glueose 23，HEpES 15，用IN NaOH将pH值调定为7.35。浴槽液和电极内液成份为(mmol/L):NaCI 150，eael:2，HEPEs 10，pH 7.4，在部分实验中选用葡萄糖酸钠替代NaCI来改变细胞膜两侧CI-浓度。DIDS、SITS、NPPB、优降糖、niflumie aeid、DTNB、DTT、GSSG、GSH、链霉蛋白酶、HEPES、EBSS、HBSS、经乙基磺酸钠均为Sigma(关lt{I))叙:W.，其它为国产分析纯试剂。1.4统计学处理全部数据以平均数士标准误(means士S.E.M)表示，统计分析采用t山西医科大学2003博士学位论文检验和ANOVA方差分析，p<0.05认为有显著性差异。2结果 2.1单通道电流记录 在对称Cl’浓度(!50八50mmol几)的情况卜，采用)JR片钳内向向外式记求技术，在32%(134/4 15)的游离膜片，}，记求到外向整流抓离r通道。单通道主要由长时间去极化激活，也有少数为自动激活。本实验使用阶跃电压刺激程序与Tabch盯ani等人基本相同。在形成游离膜片后，维持膜电位在一30 mV并持续2分钟，如果有单通道电流活动则认为是自动激活，本实验只记录到7例。否则，将膜电位去极化到十60 mV并持续3分钟;如果仍无电流活动，则采取以卜步骤激活通道:改变钳制电位从一6OmV阶跃到+60 mV(每次巧秒，共4次)，或从一90 mV阶跃到到+90 mV，或从一1 20 mV阶跃到+1 20 mV。仍然没有单通道活动的膜片则认为不含有外向整流氯离子通道。 图1为外向整流氯离子单通道电流图及其电流一电压关系曲线，从图中可以看出通道具有外向整流特性。在一60~0 mV范围(内向电流)的单通道电导为18.23士0.96 ps;而在O一十6omV范围(外向电流)的电导为42.26土1 .20 ps(n一20)。通道多呈一级开放，并且很少有其它类型通道电流的活动。 2.2通道的离子选择性分析 图2为Cl一被葡萄糖酸部分替代前后单通道电流的变化。在对称Cl-浓度(150/150mmol/L)情况下，翻转电位为一4.17士l.84mV(n二20，图ZC)。当浴槽液(细胞内侧)CI.浓度下降到30 mmol几后，电流一电压关系曲线向左移动，翻转电位变为一34.23士4.86 mV(n=5，图ZA，C):