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目的:探讨联合应用胰岛素和硫酸软骨素酶ABC对大鼠急性脊髓挫裂伤后脊髓再生修复的影响及可能机制。方法:采用改良Allen’s打击法建立T9脊髓挫裂伤模型,将SD大鼠随机分为6组:A(正常,n=4)组、B(损伤对照,n=24)组、C(ChABC, n=24)组、D(Ins,n=24)组、E(Ins +ChABC,n=24)组、F(MP,n=24)组,其中B、C、D、E、F组又分为伤后第1天,第3天,第7天,2周,4周,8周共6个亚组,每个亚组4只。A组:不进行任何干预处理;B组:SCI后30min内,腹腔注射生理盐水1ml,以后每日腹腔注射生理盐水1ml,连续1周;C、E组SCI后蛛网膜下腔放置PE-0402导管,C组SCI后30min内,向导管内注射ChABC 6μl(1U /ml),再注射生理盐水6μl,连续给药7d;E组SCI后30min内,向导管内注射ChABC 6μl(1U /ml),再注射生理盐水6μl,连续给药7d,同时在SCI后30min内,经腹腔注射普通速效Ins l IU/kg/d+50%葡萄糖1g/kg/d,分3次给药,每8h 1次,连续给药7d;D组SCI后30min内,经腹腔注射普通速效Ins l IU/kg/d+50%葡萄糖1g/kg/d,分3次给药,每8h 1次,连续给药7d;F组SCI后将16号留置针置入尾静脉,SCI后30min内,首次MP30mg/kg,作为冲击量于15分钟内静脉输入,其配制浓度是25mg/ml注射水,间隔45分钟,然后以5.4mg/kg/h,连续23小时静脉滴入。观察指标和资料收集:1.运动功能观察:各组大鼠于SCI后第1天、第3天、第7天、2周、4周、8周时行BBB评分测定。2.神经电生理检查:各组大鼠于SCI后第1天、第3天、第7天、2周、4周、8周时行脊髓感觉诱发电位和脊髓运动诱发电位检测,记录其潜伏期和波幅。3.取材:所有大鼠于神经电生理检查完毕后,取出包含损伤段的脊髓行固定,包埋。4.组织形态学观察:将所有大鼠脊髓标本切片,行HE染色、Nissl染色、神经细胞凋亡检测、GAP-43免疫组织化学检测,并采用免疫组化图像分析系统进行定量分析。5.神经束路示踪:SCI后第7周时,每组大鼠(n=4)行BDA逆行示踪,大鼠存活1周后,取脊髓标本行BDA染色显影。所有数据行方差分析统计学比较。结果:1. BBB评分:所有大鼠SCI前BBB评分均为21分,SCI后所有大鼠均出现了典型的截瘫综合征,BBB评分均为0分。伤后12h开始爬行,两后肢呈拖行,足背着地。SCI后1天、3天时所有大鼠BBB评分均为0分,3天后各组大鼠后肢运动功能开始恢复,SCI后1周,各组大鼠两后肢仍拖行,足背着地,B组BBB评分2.00分,C组BBB评分2.50分,D组BBB评分3.75分,E组BBB评分4.00分,F组BBB评分3.25分,B组与C、D、E、F组间BBB评分有明显统计学差异,P<O.O5,C、D、E、F组间BBB评分无明显统计学差异,P>O.O5。SCI后2周,各组大鼠后肢活动均较有力,足掌可以着地,爬行活动较灵活,B组BBB评分7.75分,C组BBB评分8.25分,D组BBB评分10.25分,E组BBB评分10.75分,F组BBB评分10.50分,D、E、F组间BBB评分无明显统计学差异,P>O.O5;B、C组间BBB评分无明显统计学差异,P>O.O5;B、C组与D、E、F组间BBB评分有明显统计学差异,P<O.O5。SCI后4周,各组大鼠均能用后肢负重站立,B组BBB评分12.00分,C组BBB评分12.50分,D组BBB评分13.25分,E组BBB评分14.50分,F组BBB评分14.50分,B组与C、D、E、F组间BBB评分有明显统计学差异,P<O.O5。SCI后8周,各组大鼠均能在步行中持续性脚掌站立且持续性前后肢协调运动,B组BBB评分14.25分,C组BBB评分14.50分,D组BBB评分17.25分,E组BBB评分18.75分,F组BBB评分18.50分,E、F组间BBB评分无明显统计学差异,P>O.O5;C、D组间BBB评分无明显统计学差异,P>O.O5;E、F组与C、D组间BBB评分有明显统计学差异,P<O.O5。各组在不同时间点(SCI后第7天、2周、4周、8周时)BBB评分均有明显统计学差异,P<O.O5。2.神经电生理检查:SCI后1天、3天、7天各组大鼠之间SCEP的峰潜伏期和波幅均无明显统计学差异,P>O.O5;SCI后2周,D、E、F组大鼠SCEP的峰潜伏期和波幅较B、C组有明显恢复,P<O.O5,表现为峰潜伏期缩短,波幅增大,D、E、F组间大鼠SCEP的峰潜伏期和波幅均无明显统计学差异,P>O.O5,B、C组间大鼠SCEP的峰潜伏期和波幅均无明显统计学差异,P>O.O5;SCI后4周、8周,各组大鼠SCEP的潜伏期和波幅均无明显统计学差异,P>O.O5。SCI后1天、3天、7天各组大鼠MEP的潜伏期和波幅在损伤近端都不能测出,SCI后2周,D、E、F组大鼠脊髓损伤近端MEP的潜伏期和波幅开始恢复,而B、C组大鼠损伤近端记录的MEP的潜伏期和波幅仍不能测出,D、E、F组较B、C组MEP的潜伏期和波幅有明显差别,P<O.O5;SCI后4、8周,各组大鼠脊髓损伤近端记录的MEP的潜伏期和波幅逐渐恢复,其中D、E、F组较B、C组有明显恢复,P<O.O5,而且D、E、F组每一时间段MEP潜伏期和波幅均比前一时间段有明显恢复,P<O.O5,表现为潜伏期缩短,波幅增大,D、E、F组间大鼠脊髓损伤近端记录的MEP的潜伏期和波幅均无明显统计学差异,P>O.O5,B、C组间大鼠脊髓损伤近端记录的MEP的潜伏期和波幅均无明显统计学差异,P>O.O5。在损伤远端记录到的MEP的潜伏期第1天、3天、7天时B、C、D、E、F组间无明显统计学差异,P>O.O5。第2周时B、C组间无明显统计学差异,P>O.O5;D、E、F组间无明显统计学差异,P>O.O5;B、C组与D、E、F组间有明显统计学差异,P<0.05。第4周时B、C、D、E、F组间无明显统计学差异,P>O.O5。第8周时B、C组间无明显统计学差异,P>O.O5;D、E、F组间无明显统计学差异,P>O.O5;B、C组与D、E、F组间有明显统计学差异,P<0.05。在损伤远端记录到的MEP的波幅在各个时间点均无明显统计学差异,P>O.O5。3.组织形态学观察:①HE染色及Nissl染色:SCI后1 d、3d,可见脊髓弥漫性出血,灰质内出血重于白质内出血,D、E、F组较B、C组明显为轻。尼氏体由正常的虎斑粗颗粒状逐渐溶解淡染,B、C组病变较D、E、F组严重,神经元肿胀明显,胞浆呈空泡状改变,着色神经元数量减少。SCI后7天,脊髓仍出血,着色神经元数量明显减少,损伤区组织出现大片坏死灶,坏死组织边界不清楚,炎性反应加剧,D、E、F组较B、C组为轻。SCI后2周,出血基本吸收,开始形成囊腔,脊髓损伤及周围区炎性细胞浸润减轻,尼氏体逐渐有所恢复,神经元着色也逐渐加深。SCI后4、8周,损伤处形成囊腔,边界清楚。②细胞凋亡:SCI后1天脊髓组织中即开始出现TUNEL阳性细胞,在灰质和白质中均有表达,3天时阳性细胞数较前明显增多,在第7天时,阳性细胞表达达高峰,以后逐渐下降,在第4周时,阳性细胞已很少有表达,第8周时,基本上看不到阳性细胞。在SCI后第1天、3天、7天、2周时,D、E、F组阳性细胞数明显较B、C组为少,差异有统计学意义,P<0.05;D、E、F组间阳性细胞数无明显统计学差异,P>0.05;B、C组间阳性细胞数无明显统计学差异,P>0.05。③GAP-43:SCI后第1天,GAP-43阳性细胞就开始出现,GAP-43阳性细胞主要在脊髓灰质中,在白质中也有少量表达,损伤后第7天阳性细胞数达到高峰,以后逐渐下降,尤其是B、C组下降迅速,到第4周时各组仅偶有阳性细胞的表达。在第3天、7天、2周这三个时间点,D、E、F组较B、C组阳性细胞数多且着色深,差异有统计学意义,P<0.05;D、E、F组间阳性细胞数无明显统计学差异,P>0.05;B、C组间阳性细胞数无明显统计学差异,P>0.05。4.神经束路示踪:C、D、E、F组有再生神经轴突通过囊腔,其中E组通过囊腔的神经纤维数量较C、D、F组明显为多,再生轴突长度也较长,而B组未见神经纤维通过囊腔。结论:1:胰岛素在神经系统的生长发育中起重要作用,控制神经元的形成、参与神经元的生长、发育和分化、抑制神经元凋亡、维持其存活和促进轴突出芽的作用。2:其主要作用机制是胰岛素与胰岛素受体结合后可激活胰岛素受体β亚单位的蛋白酪氨酸激酶,而后者通过作用于其下游的底物分子,引起信号转导的级联反应,从而启动胰岛素抗细胞凋亡的生物效应。途径是经IRS-1-Ras-MAPK和IRS-1-PI3K-PKB两条途径。3:ChABC能特异性破坏CSPGs的葡胺聚糖链(GAG),阻止瘢痕形成,有利于轴突生长,间接促进损伤脊髓的再生修复。4:联合应用胰岛素和ChABC治疗急性大鼠脊髓损伤的疗效优于单因素干预组,与MP相当。为急性脊髓损伤的治疗开辟了新的道路,胰岛素有望成为治疗急性脊髓损伤的新药。