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目的:大量动物实验及临床研究表明脑缺血及再灌注期间发生着复杂的病理生理变化,缺血再灌注可以启动一系列凋亡相关因子,诱导细胞凋亡,脑缺血再灌注后的神经细胞凋亡是受多种基因蛋白调控的复杂过程,目前多种神经保护剂即是通过调控凋亡蛋白来抑制细胞凋亡,达到脑保护的作用。神经生长因子(NGF)也是一种已经经临床证实有效的神经营养因子,但其具体的作用机制尚未十分清楚,研究者旨在通过对NGF应用的动态时间窗的变化以及相应时间窗内线粒体凋亡通路的始动因子caspase-9,内质网应激反应性凋亡途径的代表因子caspase-12以及即可早期基因c-jun(JNK通路相关因子)动态表达的对比研究,应用MR影像学、流式细胞学及免疫组织化学等分子影像学及分子生物学的方法来探讨NGF的保护作用的时间窗及对凋亡相关蛋白表达的影响,借以推测NGF在缺血再灌注损伤过程中的神经保护机制与多条凋亡通路的相关性。
方法:随机选取健康雄性新西兰白兔62只,随机将实验动物等分为免疫组化检测组及流式细胞检测组,两组又随机分为假手术组(n=3)、生理盐水对照组组(n=8)及NGF治疗组(n=20),按给药时间不同对照组及NGF治疗组又分为再灌注0h、1h、3h和6h组(对照组n=2,NGF治疗组n=5)。采用线栓法大脑中动脉阻断(middlecerebralarteryocclusion,MCAO)局灶性脑缺血再灌注模型,分别在缺血2h再灌注损伤后0h、1h、3h和6h应用微量进样器将等量NGF或生理盐水立体定向导入梗死灶周,其中假手术组线栓插入的深度为3cm,2h后拔退至颈总动脉,各实验组于MCAO后2h行MR检查,获取DWI图像,以确定模型成功,并用作对梗死灶进行定位的参照图像。再灌注24h、72h对实验动物行神经功能行为评分,72h作为终点时间各组分别行免疫组织化学、流式细胞学及电镜、MR影像检查观察灶周caspase-9,-12及c-jun蛋白的动态表达、灶周凋亡率及灶周超微结构、梗死体积等,利用统计学方法分析其相互之间的关系。
结果:电镜显示皮层梗死灶周区神经元具有细胞凋亡特征,缺血再灌注0h灶周给予NGF皮层神经元超微结构改变要明显好于6h给药组及对照组。缺血再灌注0h、1h、3h灶周给予NGF,梗死体积分别比对照组下降50.1%、48.4%、37.6%,相应的灶周凋亡率及凋亡基因caspase-9,-12及c-jun表达的阳性细胞平均光密度值明显下降,用药越早越明显,同时神经功能恢复越好;再灌注6h后给药,其梗死体积及凋亡蛋白的表达与对照组间无差异,说明6h用药无效。各组数据凋亡率、TUNEL阳性细胞数与凋亡蛋白表达趋势一致。
结论:
1.外源性NGF立体定向导入梗死灶周区,能够保护神经元,减少神经元坏死和调亡。
2.通过对NGF保护作用介导下的三种凋亡相关基因表达的时空动态研究,研究者发现早期应用NGF可下调caspase-9,-12及c-jun的表达,而caspase-9,-12及c-jun又分别是细胞凋亡的线粒体通路、内质网应激反应性通路及MAPK信号转导通路之JNK通路的关键分子,因此研究者认为NGF可通过下调这些凋亡相关基因的表达、抑制凋亡来发挥其神经保护作用。Caspase-9,12及c-jun的表达产物是NGF抑制的多种杀手蛋白中的一部分。这一结果也提示出,早期联合应用NGF及caspase抑制剂其神经保护作用可能会更显著。
3.本实验对外源性NGF在缺血再灌注损伤中作用的时间窗进行了首次研究,提出NGF最佳用药时间点为再灌注3h之内。
4.本实验表明,NGF神经保护作用下的MR影像学的动态演变与反映DNA水平的免疫组化及流式细胞术所检测的结果相一致,DNA说明MR能在活体状态下对NGF疗效进行相当于基因水平的客观评价,具有较好的临床应用价值。