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目的:研究杨梅总黄酮(Total flavonoids extracted from Bayberry bark,TFB)对缺血性心脏病的保护,并初步探讨其作用机制。方法:本实验分别从体内和体外两方面进行研究和验证。首先,利用健康的雄性SD大鼠,用药治疗15 d后,皮下注射异丙肾上腺素造成大鼠急性心肌缺血,然后对血清中心肌三酶(CK,AST和LDH)水平、心肌组织匀浆中抗氧化酶(SOD和CAT)活性以及病理情况进行观察分析。实验分为6组:正常组(C组),模型组(ISO组),模型+杨梅总黄酮低、中、高剂量组(ISO+TFB5,10,20mg/kg),阳性药组(Di-ao80mg/kg)。其次,我们利用了体外培养的H9c2心肌细胞,建立心肌缺氧/复氧损伤模型,模拟人体内心肌缺血再灌注损伤的病理过程,观察杨梅总黄酮对缺氧/复氧诱导的H9c2细胞损伤的影响。实验共分5组:正常对照组(C组),模型组(H/R组),缺氧/复氧模型+杨梅总黄酮低、中、高剂量组(1.5625,3.125,6.25 μg/mL)。我们分别采用了以下方法对相应指标进行检测:四甲基偶氮唑蓝(methylthiazolyltetrazolium,MTT)法检测细胞存活率;收集细胞上清液,按照产品说明书分别检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)的活力,丙二醛(malondialdehyde,MDA)的含量以及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-PX)的活性;Carboxy-H2DCFDA染色法,流式细胞仪检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平;AnnexinV/PI双染法,流式细胞仪检测细胞凋亡情况;JC-1荧光标记法,流式细胞仪检测心肌细胞线粒体膜电位的变化;Caspase-3试剂盒检测细胞内Caspase-3的活性;免疫印迹(Westernblot)法检测机制相关蛋白的表达。结果:(1)杨梅总黄酮对大鼠血清中、心肌匀浆组织中生化变量的影响:与模型组相比,杨梅总黄酮治疗能够显著降低CK、AST、LDH、MDA水平(P<0.05),升高SOD、CAT的活性(P<0.05);(2)杨梅总黄酮对大鼠心脏病理学变化的影响:结果显示,空白对照组没有显著异常,并且排列整齐;而模型组出现了心肌坏死,组织纤维化,嗜中性粒细胞浸润的现象;(3)杨梅总黄酮对H9c2细胞存活率的影响:实验视正常对照组细胞存活率为100%,与正常组比,模型组细胞存活率下降到73.97±4.55%;与模型组相比,治疗组对缺氧/复氧诱导的损伤的保护作用呈剂量依赖性。当杨梅总黄酮浓度为6.25μg/mL作用12h时,细胞存活率升高到89.83±4.07%。以上的结果表明,杨梅总黄酮的最佳作用浓度是6.25 μg/mL,最佳的作用时间是12 h;(4)杨梅总黄酮对H9c2细胞中LDH和MDA水平以及SOD、CAT、GSH-PX活性的影响:与正常组相比,当细胞缺氧/复氧后,LDH、MDA水平显著增加(P<0.05),经杨梅总黄酮治疗后,其水平显著下降(P<0.05);同时,与正常组相比,模型组内源性抗氧化酶的活性下降,杨梅总黄酮治疗后,抗氧化酶活性显著升高(P<0.05);(5)杨梅总黄酮对H9c2细胞内活性氧(ROS)水平的影响:与正常对照组比较,模型组ROS水平显著升高(P<0.05),经杨梅总黄酮治疗后,ROS水平显著下降(P<0.05);(6)杨梅总黄酮对H9c2细胞凋亡情况的影响:分析结果后显示,正常组细胞的凋亡率是4.09%,杨梅总黄酮单给药组细胞凋亡率是2.03%,而模型组细胞凋亡率是11.04%,缺氧/复氧后杨梅总黄酮治疗组细胞凋亡率是4.62%;(7)杨梅总黄酮对H9c2细胞内线粒体膜电位的影响:正常组阳性细胞率是94.57%,而模型组中,阳性细胞率下降至66.92%,经杨梅总黄酮治疗后,阳性细胞率上升到90.26%;(8)杨梅总黄酮对H9c2细胞内Caspase-3活性的影响:与正常组比较,模型组中Caspase-3活性显著增强,而经杨梅总黄酮治疗后,Caspase-3活性显著下降(P<0.05);(9)杨梅总黄酮对H9c2细胞内相关蛋白表达的影响:缺氧后我们用杨梅总黄酮作用不同时间(0h-24h),结果发现各蛋白在不同的时间点均有变化,Bax表达显著降低(P<0.05),Procaspase-3,Bcl-2,P-AKT,P-GSK3β和 P-ERK 在不同时间点表达均显著升高(P<0.05),而总的AKT,GSK3β和ERK的表达水平却没有改变(P>0.05);我们又进一步探讨了杨梅总黄酮后处理对正常细胞及缺氧后细胞的影响,与模型组相比,缺氧后杨梅总黄酮处理组P-AKT,P-GSK3β和P-ERK的表达显著升高(P<0.05),这四组总的AKT,GSK3β和ERK的表达水平没有显著性变化(P>0.05);加抑制剂(LY294002)后,杨梅总黄酮处理组的Bax表达显著降低(P<0.05),Bcl-2,P-AKT,P-GSK3β和P-ERK的表达显著升高(P<0.05),然而,用50 μmol/L的LY294002作用2 h后,Bax表达显著升高(P<0.05),Bcl-2,P-AKT,P-GSK3β和P-ERK的表达显著降低(P<0.05)。结论:杨梅总黄酮对异丙肾上腺素诱导的大鼠急性心脏病具有保护作用;杨梅总黄酮具有抗氧化、抗凋亡的作用;杨梅总黄酮对缺氧/复氧诱导的H9c2细胞损伤的保护可能与其后给药激活AKT蛋白,并促进GSK-3β和ERK蛋白磷酸化,同时,能够促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,抑制促凋亡蛋白Bax的表达,从而降低Bax/Bcl-2的比值,达到抗凋亡的作用有关。