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目的观察丹参红花(丹红)有效成分(丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B、羟基红花黄色素A)配伍对原代培养的乳鼠海马神经元细胞缺氧损伤的保护作用,并初步探讨丹红有效成分配伍对原代培养乳鼠海马神经元细胞缺氧损伤的保护机制,进一步研究其配伍规律,阐述中药配伍规律的科学性。方法1.以原代培养的乳鼠海马神经细胞为研究对象,建立海马神经元细胞缺氧损伤模型。2.MTT法确定丹红有效成分、尼莫地平、阿司匹林对海马神经元细胞的非毒性剂量;选取合适浓度分组:正常组、模型组、阳性对照组及丹红四个有效成分组成的9个配伍组。3.化学比色法测定神经细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)含量、TBA法测定神经细胞内丙二醛(MDA)水平以及黄嘌呤氧化酶法测定胞内总超氧化物歧化酶(T-SOD)的活性的变化。4.ELISA法测定神经细胞内6酮前列腺素F1a((6-keto-PGF1a)和血栓素B2(TXB2)水平的变化5.激光共聚焦技术测定神经元细胞内线粒体膜电位(Mitochondrial membrane potential,MMP)和胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)的变化、流式细胞仪检测神经元细胞的早期凋亡率。结果1.乳鼠海马神经元离体培养8d后,神经细胞清晰可见,多呈锥体状或多级形,胞体有明显的折光性,立体感强,细胞膜边界光滑、清楚,神经突起相互交错成网。用NSE免疫组织化学染色法鉴定海马神经元细胞,神经元细胞占比大于90%。2.药物毒性实验:通过MTT实验确定丹红各有效成分对海马神经元的最佳浓度梯度(丹参素 50、100、150μg/mL;原儿茶醛 60、120、180μg/mL,丹酚酸 B50、100、150μg/mL;羟基红花黄色素A40、80、120μg/mL),按高中低浓度正交配伍。尼莫地平浓度100μg/mL、阿司匹林200μg/mL作为阳性对照。3.抗氧化损伤:配伍1～3、5～9组组方能显著抑制上清液LDH含量;配伍1、2、3、4、8、9组组方能明显增强SOD活性;配伍1、2、3、7、8、9组组方能显著降低MDA水平。正交设计直观分析丹参素和原儿茶醛的抗氧化作用最强。4.抗血栓形成:配伍1、2、3、4、5、6组组方能显著升高6-keto-PGF1a的水平;配伍7、8组组方能显著降低TXB2的水平。正交设计直观分析和方差分析可知,可能丹参素的抗血栓作用最强。5.抗凋亡损伤:配伍1～3、5～9组组方能显著升高MMP水平;配伍1～3、5～9组组方能明显抑制胞内钙超载现象;1～4、6～9组组方能显著抑制细胞早期凋亡。正交设计直观分析可知,原儿茶醛的抗凋亡作用最强。结论1.本实验成功培养原代海马神经元细胞并体外建立缺氧损伤模型2.丹红有效成分配伍对缺氧损伤海马神经元具有保护作用。3.丹红有效成分配伍对缺氧损伤海马神经元细胞的保护作用机制可能与抑制氧化应激损伤、抗血栓形成、减轻胞内钙超载和抑制细胞凋亡有关。