论文部分内容阅读
目的:分析新疆葡萄树伤流液的抗氧化活性和组成成分,确定新疆喀什木纳格葡萄树伤流液中的抗氧化活性成分分离纯化工艺,对所得单一组分进行结构鉴定;并对其中多糖组分进行分离纯化和活性研究。探究苯乳酸和温度对伤流液抗氧化活性和成分稳定性的影响。为新疆葡萄树伤流液的基础研究奠定理论基础。方法:1以新疆不同品种、产地的11种葡萄树伤流液为研究对象,测定其对ABTS+·、·OH、DPPH·、O2-·、NO2-·的清除能力进行测定并进行统计分析。采用MTT法测定新疆葡萄树伤流液对PC12细胞生长情况的影响;测定不同剂量新疆葡萄树伤流液对H2O2所致PC 12细胞氧化损伤的影响。2采用经典的定性实验对新疆葡萄树伤流液中的皂苷、蛋白、生物碱、多糖、黄酮进行定性鉴别。采用恒重法对新疆6种葡萄树伤流液进行水分测定;以牛血清蛋白为对照品,采用考马斯亮蓝法对蛋白含量进行测定;以没食子酸为对照品,采用Folin-Ciocalteu法对多酚含量进行测定;以葡萄糖为对照品,采用蒽酮硫酸法对多糖含量进行测定;以齐墩果酸为标准品,采用香草醛-冰乙酸显色法测定皂苷的含量。3以DPPH·和·OH清除率和吸附率为评价指标对8种不同型号大孔树脂:AB-8、D101、HPD400、HPD500、HPD826、LSA-21、HPD100、NKA-9进行筛选,确定最合适的大孔树脂;并对所筛选的树脂进行分离条件的确定。进一步采用Sephadex LH-20和C18对大孔树脂纯化组分进行再纯化,确定分离条件,HPLC探究每一纯化步骤的必要性;制备液相两步分离条件确定。对所得单一组分进行NMR/MS分析、解谱、确定结构。4水提醇沉法提取新疆喀什木纳格葡萄树伤流液中多糖,DEAE-52、Sephadex G150纯化,气相色谱确定单糖组成,并进行抗氧化活性测定。4探究苯乳酸对伤流液·OH清除率、成分、物理外观变化的影响。以·OH清除率为衡量标准,对处于4℃、20℃、37℃、47℃、57℃条件下的喀什木纳格葡萄树伤流液进行抗氧化活性跟踪,观察其物理形态的变化和伤流液中的多糖、蛋白、皂苷、多酚组分的含量变化。结果:1新疆11种不同产地品种的葡萄树伤流液对·OH、ABTS+·、DPPH·、NO2-·、O2-·均具有一定的清除能力,且对·OH清除能力最强。这五种自由基清除率测定方法来测定伤流液抗氧化活性,可以反映出伤流液抗氧化活性的差异。2015年喀什木纳格葡萄树伤流液在培养时间96h内,对PC12细胞生长有促进作用,对H2O2所致的PC12细胞氧化损伤有一定的保护作用,可以提高其中GSX-PX的活性,可以减少LDH的泄露。2进行试验的六种葡萄树伤流液中含有氨基酸、蛋白质、糖类及其苷类、皂苷,不含黄酮和生物碱。新疆葡萄树伤流液中的固形物含量仅有0.2%左右,99.8%都是水。蛋白、多糖、皂苷、多酚含量在不同葡萄树伤流液之间有一定的差异。3纯化新疆喀什木纳格葡萄树伤流液中抗氧化活性组分的条件是:HPD400型大孔树脂纯化条件为:上样量1个柱体积,60%乙醇洗脱5个柱体积,上样流速2mL·min-1,洗脱速度5mL·min-1,除杂用水6个柱体积。C18纯化条件为:上样量≤1mL,不控制上样流速和洗脱速度,50%甲醇洗脱3BV。制备液相经两次分离,HPLC-DAD/NMR/MS分析得到9个化合物,分别为16min（2,3-二羟丙基-半乳糖苷和尿嘧啶）,18min（苯乳酸,4-羟基-5甲基-2嘧啶酮和丙三醇）,19min（4-羟基,2-酮嘧啶-α-呋喃糖苷）,23min（5-甲基尿嘧啶）,30min（苯丙氨酸）,70min（α-羟基-N-甲基苯丙酰胺）。3喀什木纳格葡萄树伤流液DEAE-52纯化得到8个多糖组分。经Sephadex G150纯化得到4个组分GBSK-1、GBSK-2、GBSK-3、GBSK-5,其对五种自由基具有不同程度的清除能力。多糖组分GBSK-3的单糖组成较简单,主要由木糖组成;GBSK-2,GBSK-5的单糖组成相似主要由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成;GBSK-1的单糖组成相似主要由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成。4相对于伤流液原液,苯乳酸加入量大于5mg·mL-1可以显著提高新疆吐鲁番葡萄树伤流液高羟自由基清除率的保持时间;和田红葡萄树伤流液和喀什木纳格葡萄树伤流液中加入苯乳酸量大于1Omg·mL-1时,可以使其羟自由基清除率相对于苯乳酸加入量少的伤流液的保持的时间更长久一些。同时,加入适量的苯乳酸,可以保护伤流液中蛋白、多糖、多酚、皂苷组分,沉淀产生时间延后,且和苯乳酸的加入量呈正相关。温度实验的结果显2015年喀什木纳格葡萄树伤流液为20℃,较高的放置温度可以使多糖组分含量有所增加。结论:1新疆葡萄树伤流液具有很好的抗氧化活性。葡萄树伤流液中含有氨基酸、蛋白质、糖类及其苷类、皂苷,不含黄酮和生物碱,各组分含量在不同葡萄树伤流液之间有一定的差异。新疆葡萄树伤流液中的固形物含量仅有0.2%左右,99.8%都是水。分离纯化新疆喀什木纳格葡萄树伤流液得到9个化合物,其中两个为新的化合物。伤流液中多糖组分的单糖组成有一定的差异,且具有一定的抗氧化活性,多糖是伤流液中的活性物质之一。相对于伤流液原液,加入适当量的苯乳酸可以保护伤流液中蛋白、多糖、多酚、皂苷组分,延缓沉淀产生,并且和苯乳酸的加入量呈正相关。新疆喀什木纳格葡萄树伤流液羟自由基清除率在常温条件下的稳定性高于其他温度。这些实验结果为新疆葡萄树伤流液后续的研究奠定了理论基础。