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近年来,胚胎干细胞(Embryonic stem cells, ESCs)以其所具有的全能性、多能性、可操作性及可塑性等诸多优点,成为医学和生命科学领域研究的热点问题之一。小鼠胚胎干细胞(mESCs)已在发育生物学、人类疾病和药物开发等研究领域中得到广泛应用,小鼠ESCs建系技术的丰富完善为建立人类和动物ESCs系提供了参照标准和理论依据。本实验以12.5~13.5d ICR小鼠胎儿制备小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层,比较了甘油和DMSO分别作为冷冻保护剂对MEF冷冻效果的影响;以3.5dICR小鼠胚胎为实验材料,探讨了胚胎不同发育阶段、血清、生长因子及传代方法对ICR小鼠ES细胞分离培养的影响。实验结果如下:1.在小鼠胚胎成纤维细胞冷冻时,采用含10%甘油的DMEM溶液作为常规冷冻保护液效果好于含10%DMSO的DMEM溶液,细胞活力分别为0.787,0.728。2. 3.5d的ICR小鼠胚胎大多为囊胚或桑椹胚,接种到MEF饲养层后,以含15%FBS的ES细胞培养液培养,囊胚的贴壁率与ICM增殖率(75.4%,72.8%)均显著高于桑椹胚(57.9%,52.6%)(P<0.05),且桑椹胚的贴壁及增殖速度都比囊胚缓慢,因此以囊胚进行ICM的分离培养效果更佳。3.以ICR小鼠囊胚为材料,采用含15%FBS的ES细胞培养液的囊胚贴壁率及ICM增殖率(79.3%,69%)均比含15%KSR、5%FBS+10%KSR的细胞培养液高(42.9%,28.6%;75%,54.2%),即培养液中添加15%FBS更有利于囊胚贴壁与ICM增殖,添加5%FBS+10%KSR更能满足小鼠ES细胞在传代培养过程中的生长需要,小鼠ES集落最高传至6代。4.在对培养液中添加的因子进行比较时,与无因子的对照组相比,培养液中添加因子对囊胚贴壁、ICM增殖及传代均起到积极作用。添加10ng/mL LIF+ 10ng/mL SCF的效果比单独添加一种因子的效果好,小鼠ES细胞最高传至6代,高于单独添加一种因子的传代数(4代,2代)。5.用含15%FBS的ES细胞培养液分离获得的小鼠ICM分别采用3种传代方法进行传代,传代时采用5%FBS+10%KSR的ESCs培养液。采用差异贴壁法传代效果最佳,最高传至8代,酶消化法传至4代,机械加酶消化法传至6代。6.实验获得了具有典型ES集落形态的ICR小鼠ES细胞,经AKP染色呈阳性。7.本实验对ICR小鼠ES细胞进行悬浮培养获得了类胚体,在体外培养过程中小鼠ES细胞自发分化为成纤维样细胞、上皮样细胞、脂肪样细胞及神经样细胞等,并出现空泡化。目前,关于人及小鼠ESCs建系的研究已有详细的报道,但家畜ESCs的研究依然处于初级阶段,很少有关于家畜ESCs建系的报道。山羊胚胎干细胞(ESCs)和胚胎生殖细胞(EGCs)是生产转基因动物、克隆动物,制备乳腺生物反应器等的理想候选细胞,然而至今仍没有成功建系的报道。本实验以30~50d的山羊胎儿及6~8d的山羊囊胚为实验材料,比较了饲养层及生长因子对分离培养山羊ES细胞的影响。实验结果如下:1.实验以机械法分离获得的山羊ICM为材料,对比了MEF、GEF两种饲养层及两种含不同因子的培养液对山羊ES细胞的影响,结果表明采用MEF饲养层ICM增殖率优于GEF饲养层;与对照组相比,培养液中添加LIF及SCF或胰岛素对山羊ICM的贴壁、增殖及传代都有积极影响;以MEF为饲养层,培养液中同时添加LIF和SCF时,培养山羊ES细胞的效果最佳,传至3代。2.实验获得了具有典型ES集落形态的山羊ES细胞,经AKP染色呈阳性。3.实验过程中,山羊ES细胞自分化为成纤维样细胞、上皮样细胞、脂肪样细胞及神经样细胞等。