研究背景与目的近年来,随着临床上碳青霉烯类抗生素的应用越来越广泛,在抗生素的选择压力下,对碳青霉烯类抗生素耐药的细菌逐年增多。耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌引起医院感染的报道呈全球性增加。鲍曼不动杆菌生存能力和黏附能力强,广泛存在医院环境中,易定植在患者身体和医院的医疗器械上且能存活时间较长。耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌,对几乎所有的p-内酰胺酶类抗生素耐药,能引起免疫低下患者的感染率和病死率增高,已经引起了全世界的瞩目。耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌耐碳青霉烯类抗生素主要机制是产苯唑西林酶和产金属p-内酰胺酶。整合子和插入序列共同区(insertion sequence common region,ISCR)广泛存在于细菌基因组,整合子特异性捕获外源性的耐药基因盒并整合在自身基因组上而获得耐药性,ISCR可以通过滚环复制的方式任意移动相近的DNA片段,为细菌耐药性的传播扩散提供高效的媒介。人的肠道是各种耐药细菌及耐药基因储存的场所及临床感染来源,耐药细菌及耐药基因可以随粪便排出污染周围环境等进行传播扩散。鲍曼不动杆菌的最主要传播方式是接触传播,在医院内范围内,消毒不彻底的医疗器械和医务人员的手是最常见的传播媒介。本研究选取本院耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌分离率最高的科室,对患者临床样本及患者入院当天粪便标本分离的耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌进行耐药基因及分子流行病学研究。对常见的碳青霉烯酶基因及耐药基因转移元件如整合子和ISCR进行检测,并进一步检测并通过进行同源性分析确定整合子和ISCR所携带的耐药基因盒,随后进行ERIC-PCR及聚类分析研究克隆相关性。将碳青霉烯酶基因及耐药基因转移元件的检测结果、ERIC-PCR及聚类分析结果、与患者的临床资料结合起来,进行综合分析,对判断耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌感染患者是散发还是暴发／流行,粪便中耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌是否为临床感染来源意义重大。针对给临床治疗带来严峻挑战的耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌,本研究建立了一种能够快速、敏感、特异、经济完成检测的多重实时荧光PCR方法。研究方法1.临床标本耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌分离株的收集收集2014年7月～12月神经外科、呼吸内科、血液科送检的各类临床标本中分离的耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌,对亚胺培南和美罗培南及其他临床常用抗生素均耐药,除对多粘菌素和(或)替加环素敏感,药敏试验参考CLSI的标准。BD Phoenix100鉴定为醋酸钙-鲍曼不动杆菌复合体的菌株,PCR检测鲍曼不动杆菌特异基因。对所有菌株进行转种、保存并提取细菌全基因组DNA。2. 患者粪便中耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌分离鉴定及药敏试验2014年7月-12月对神经外科、呼吸内科、血液科各收集600个患者入院当天粪便常规检查剩余标本,用麦康凯培养基(含2mg/L的美罗培南)筛选耐碳青霉烯革兰阴性杆菌。对所有菌株进行转种、保存并提取细菌全基因组DNA。PCR检测鲍曼不动杆菌特异基因,利用BD phoenix 100全自动微生物鉴定仪器对鲍曼不动杆菌特异基因阳性的菌株进行确证和MIC药敏试验,药敏试验参考CLSI的标准。3. 检测常见碳青霉烯酶基因PCR检测临床标本及粪便标本中分离的耐碳青霉烯鲍曼不动杆的常见碳青霉烯酶基因blaNDM、blaVIM、blaIMP、blaOXA-23-like、 blaOXA-24-like、bla OXA-51-like和blaOXA-58-like,将阳性PCR产物进行测序,进一步确定其亚型。4. Ⅰ类整合子及其基因盒检测检测Ⅰ类整合酶基因,筛选出携带Ⅰ类整合子的细菌,再进一步扩增其可变区。对可变区阳性的标本,根据限制性内切酶RsaI和Hinf I酶切图谱进行分类,挑取不同谱型的标本进行测序,通过分析序列的同源性,得出对应可变区的耐药基因盒排列类型。5. ISCR及其基因盒检测检测ISCR1基因,筛选出携带ISCR1基因的细菌,再进一步扩增其可变区。对可变区阳性标本,根据限制性内切酶RsaI和HinfⅠ酶切图谱进行分类,挑取不同谱型的标本进行测序,通过分析序列的同源性,得出对应可变区的耐药基因盒排列类型。6. ERIC-PCR对于所有菌株进行ERIC-PCR基因分型及电泳图谱聚类分析,研究其克隆相关性。7. 耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌多重实时荧光PCR检测方法的建立设计2组引物,1组分别特异扩增不动杆菌属recA基因、鲍曼不动杆菌16S-23S rRNA间隔区(intergenic spacer, ITS)基因和blaNDM基因,另1组分别特异扩增blaOXA-23-like、blaOXA-24-like、blaOXA-51-like和blaOXA-58-like基因,要求扩增产物Tm值相差大于1.5℃以便于准确区分不同基因,对所有引物及其扩增产物进行同源性比对,均未见除目的基因外的其他同源序列。以本实验室前期保存的,经过普通PCR及测序验证含有目的基因的临床菌株为阳性对照,建立多重实时荧光PCR结合熔解曲线分析的方法检测耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌。利用单重实时荧光PCR分别对7个目的基因进行特异性检测,在特定的引物下同时对靶核酸序列和非靶核酸序列及灭菌去离子水进行PCR扩增,进行特异性评价。阳性对照菌株构建重组质粒以后,提取重组质粒DNA定量后进行一系列10倍稀释,使最终于反应管中的DNA含量依次相当于106、105、104、103、102、10copies/μl。反应体系的敏感性评价则用上述浓度的重组质粒DNA进行。分别选用7个目的基因104 copies/μl重组质粒DNA进行批内、批间重复试验。分析整理批内、批间的Ct值,对反应体系的重复性及稳定性进行评价。利用400株临床分离的耐碳青霉烯不动杆菌(228株鲍曼不动杆菌,178株非鲍曼不动杆菌)进行反应体系的临床菌株检测评价。以普通PCR及电泳作为评价该反应体系的方法对照。将含已知目的基因的耐碳青霉烯不动杆菌菌株调制生理盐水混悬液,包括101-108cfu/ml系列浓度,分别取200μl加入1.8m1粪便或痰液中制备模拟标本,磁珠法提取模拟标本的DNA,探讨本研究建立的多重实时荧光PCR检测方法用于直接检测临床标本中耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌应用前景。研究结果1. 临床标本耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌分离株的收集参照BD Phoenix100鉴定及药敏结果,结合PCR检测鲍曼不动杆菌特异基因Ab16S-23S rRNA ITS的结果,临床样本共分离出76株耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌,其中神经外科35株、呼吸内科20株、血液科21株。2. 粪便标本耐碳青霉烯鲍曼不动的分离鉴定从1800份粪便标本中共筛查到140株耐碳青霉烯细菌,结合PCR检测鲍曼不动杆菌特异基因Ab16S-23S rRNA ITS的结果,有20株为鲍曼不动杆菌。其中神经外科6株、呼吸内科9株、血液科5株。3. 碳青霉烯酶基因检测结果常见碳青霉烯酶基因blaNDM/blaVIM、blaIMP、 blaOXA-23-like、blaOXA-24-like、bla OXA-51-like和blaOXA-58-like检出率分别为4.1%、22.9%、26.0%、67.7%、63.5%、46.8%、65.6%。4. Ⅰ类整合子及其基因盒检测结果96株耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌中,60株整合酶Ⅰ基因呈现阳性扩增,其中47株可变区呈现阳性扩增。经PCR-RFLP分析,47株Ⅰ类整合子可变区共分为12个类型,挑选不同类型分别测序,12个类型的基因盒中共包括21种不同的耐药基因,主要包括氨基糖苷类耐药基因(aadA1,aadk2,aadA4,aadA5,aadA24-like,aadB),氯霉素耐药基因(cat, catB3, catB8,catB-like)、甲氧苄啶耐药基因(dfrA1,dfrA12,dfrA25),β-内酰胺酶基因(blaOXA-30, blaPSE-1, blIMP-1),以及少见的利福平耐药基因(arr-3)及喹诺酮类耐药基因(qnrVC-like)。catB3--qnrVC-like--aacA4和aacA4--blaIMP-1--blaoxA-30-- catB3耐药基因盒排列组合为首次在鲍曼不动杆菌中发现。5. ISCR1及其基因盒检测结果96株耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌中,53株ISCR1呈现阳性扩增,33株可变区呈现阳性扩增。经PCR-RFLP分析,33株ISCR1可变区共分为6个类型,挑选不同类型分别测序,6种类型的基因盒中共包括11种不同的耐药基因盒,主要包括β-内酰胺酶基因(blaPER-1,blaPSE-1)和喹诺酮类耐药基因(qnrA1,qnrB2)。6. ERIC-PCR基因分型及聚类分析96株耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌的电泳图谱及聚类分析结果,在80%的相似水平聚为89个类群,聚类结果结合患者临床资料分析,不存在同一克隆群。7. 多重实时荧光PCR检测方法的建立、评价及应用探讨建立2组多重实时荧光PCR检测方法,1组同时检测不动杆菌属recA基因、鲍曼不动杆菌16S-23S rRNA ITS基因和blaNDM基因,另1组同时检测blOXA-23-like、 blaOXA-24-like、blaOXA-51-like和blaOXA-58-like基因。两组多重实时荧光方法均可特异扩增目的基因并呈现特异熔解峰,最低可检测靶基因10 copies/μl,在检测靶基因10～106范围内相关系数0.99,批间及批内重复试验Ct值变异系数均小于4.2%。检测临床分离的400株耐碳青霉烯不动杆菌,用普通PCR及基因测序作为对照方法,本研究建立的多重荧光PCR方法检测结果与对照方法均一致。粪便及痰液模拟标本多重实时荧光PCR结果与纯培养菌株的检测结果均一致,模拟标本中各类耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌的检测最低浓度均为102cfu/ml。结论1. 本研究对96株耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌检测常见碳青霉烯酶基因,其中OXA酶的blaOXA-23-like、blaOXA-24-like、blaOXA-51-like和blaOXA-58-like基因均具有较高的携带率,表明产OXA酶是耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌耐碳青霉烯类抗生素的最重要机制。2. 本研究中Ⅰ类整合子可变区检出12种不同类型的基因盒排列类型,携带21种不同类型耐药基因,主要包括氨基糖苷类耐药基因、氯霉素耐药基因、甲氧苄啶耐药基因、β-内酰胺酶基因。其中,catB3--qnrVC-like--aacA4和aacA4--blaIMP-1-blaOXA-30--catB3耐药基因盒排列组合为首次在鲍曼不动杆菌中发现。3. 本研究中ISCR1可变区检出6种不同类型的基因盒排列类型,检出携带11种不同类型耐药基因,主要包括β-内酰胺酶基因和喹诺酮类耐药基因。4. 本研究中耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌Ⅰ类整合子和ISCR1的携带率均较高,Ⅰ类整合子可变区及ISCR1可变区分别携带21种和11种不同类型耐药基因,相应的耐药基因覆盖了临床常用种类抗生素,表明Ⅰ类整合子和ISCR1在介导多重耐药及耐药基因的水平传播中具有重要作用。5. ERIC-PCR基因分型及聚类分析,结合耐药基因研究结果可用于阐明耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌感染是散发还是暴发／流行。6. 成功的建立了一种快速检测耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌的多重实时荧光PCR方法,能对携带blaNDM、blaOXA-23-like、blaOXA-24-like、bla OXA-51-like和blaOXA-58-like基因的鲍曼不动杆菌和非鲍曼不动杆菌进行快速检测及区分,并具有直接应用于检测临床样本中携带blaNDM、blaOXA-23-like、blaOXA-24-like-bla OXA-51-like和blaOXA-58-like基因的不动杆菌的广泛前景。