论文部分内容阅读
目的1.观察锌是否诱导线粒体STAT3丝氨酸残基(Ser727)磷酸化来改善再灌注心肌线粒体的氧化磷酸化能力以及减少再灌注期线粒体活性氧的产生。2.探讨锌诱导线粒体STAT3丝氨酸残基磷酸化而发挥抗心肌缺血/再灌注损伤保护作用的线粒体机制。方法建立大鼠心肌缺血/再灌注模型和心肌细胞H9c2缺氧/复氧模型。用Western blotting实验技术检测心肌组织与心肌细胞以及线粒体p-STAT3、STAT3、p-ERK、ERK、Tubulin、COX IV的蛋白表达;用免疫荧光法检测STAT3和Mitotracker Red的共定位;利用高分辨率呼吸测定仪分别测定心肌组织与H9c2心肌细胞线粒体的氧化磷酸化水平和电子传递链功能;用ATP和柠檬酸合成酶检测试剂盒分别测定心肌组织ATP水平和柠檬酸合成酶的活性;利用JC-1、DCFH-DA以及Mitosox Red探针测定H9c2心肌细胞的线粒体膜电位（△Ψm）及细胞内、线粒体内ROS水平。用实时定量PCR技术（Q-PCR）检测心肌组织和H9c2心肌细胞线粒体基因ND1、ND5和ND6 mRNA表达水平;利用琥珀酸脱氢酶（SDH）检测试剂盒检测心肌组织和H9c2心肌细胞的琥珀酸脱氢酶活性。结果1.Western blotting和共聚焦显微镜的实验结果显示,常氧条件下ZnCl2诱导心肌组织和H9c2心肌细胞STAT3第727位点丝氨酸(Ser727)的磷酸化,并且能够促进磷酸化的STAT3转移到线粒体内,而ZnCl2的这一作用则被选择性锌离子螯合剂TPEN所阻断。2.在常氧条件下,选择性锌离子螯合剂TPEN处理后使心肌组织STAT3的磷酸化水平减少,而线粒体内STAT3的磷酸化水平未发生改变,表明内源性锌离子的水平与STAT3的磷酸化有关。3.Western blotting的实验结果显示,缺血/再灌注和缺氧/复氧条件下,ZnCl2能够诱导再灌注心肌和复氧细胞的STAT3磷酸化,并且使再灌注心肌和复氧细胞的线粒体STAT3的磷酸化和总STAT3含量也增加,而ZnCl2的这一作用可被选择性锌离子螯合剂TPEN所阻断,这些结果表明缺血再灌注条件下锌离子能够诱导心肌组织和细胞STAT3磷酸化,并使磷酸化的STAT3转移到线粒体。4.Western blotting实验结果显示,ZnCl2能够激活ERK,并且通过ERK来诱导常氧和再灌注心肌STAT3丝氨酸残基磷酸化,而这一作用被MEK抑制剂PD98059所阻断,表明ERK介导ZnCl2诱导的STAT3的丝氨酸残基磷酸化。5.高分辨率呼吸测定系统（Oxygraph-2K）的实验结果显示,ZnCl2提高常氧和再灌注心肌线粒体的呼吸功能、ATP的生成以及柠檬酸合成酶的活性,而ZnCl2的这一作用是通过线粒体磷酸化STAT3来实现的。这些结果表明,ZnCl2通过线粒体磷酸化的STAT3来改善再灌注心肌线粒体的氧化磷酸化,从而发挥抗缺血/再灌注损伤的心肌保护作用。6.共聚焦显微镜实验结果显示,在H9c2细胞缺氧/复氧模型中,复氧后细胞和线粒体内的ROS水平明显增加。而ZnCl2可减少复氧后细胞和线粒体内ROS的水平,表明ZnCl2可减少复氧时ROS的产生。进一步的实验显示,ZnCl2这一作用被STAT3突变质粒（S727A）所阻断,表明线粒体丝氨酸磷酸化的STAT3介导ZnCl2的抗氧化应激损伤的心肌保护作用。7.在缺氧/复氧模型,ZnCl2可防止缺氧/复氧所引起的线粒体膜电位的降低,抑制mPTP的开放,而ZnCl2的这种保护作用被STAT3突变质粒（S727A）所阻断,这表明丝氨酸残基磷酸化的STAT3介导ZnCl2抗缺氧/复氧损伤的心肌保护作用。8.PCR实验结果显示,ZnCl2通过诱导STAT3丝氨酸磷酸化来增加再灌注心肌线粒体基因ND6的mRNA表达水平,表明ZnCl2能够防止再灌注心肌线粒体DNA的损伤,进而改善再灌注心肌线粒体的氧化磷酸化能力。9.ZnCl2通过诱导STAT3的丝氨酸磷酸化来抑制H9c2心肌细胞复氧早期线粒体琥珀酸脱氢酶（SDH）的活性,从而减少ROS的产生。结论1、锌离子通过ERK信号通路来诱导心肌STAT3的丝氨酸磷酸化,并促进磷酸化的STAT3转移到线粒体内。2、锌离子通过线粒体磷酸化的STAT3改善再灌注心肌线粒体的氧化磷酸化功能并抑制再灌注早期线粒体ROS的产生。3、锌离子通过丝氨酸磷酸化的STAT3防止线粒体ND6基因的损伤,进而来改善再灌注期线粒体氧化磷酸化的功能。4、锌离子通过丝氨酸磷酸化的STAT3抑制SDH活性,进而减轻再灌注早期ROS的产生,从而保护再灌注心脏。