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蓝藻Synechococcus elongatus PCC 7942(S.elongatus PCC 7942)是研究生物钟节律性的最简单模式生物之一,其基因组中绝大多数基因的转录活动都受到内源生物钟的调控。Kai ABC基因簇编码了该种蓝藻生物钟核心震荡器的基本分子组件,在蓝藻生物钟节律性的分子调控过程中起着至关重要作用。温度补偿特性是所有已知生物钟模型的基本属性之一,人们在以蓝藻S.elongatus PCC 7942为对象的生物钟节律性研究中发现,温度补偿属性的产生与维持往往与Kai基因家族的功能紧密相关。本实验室在前期工作中筛选得到一个Kai ABC基因簇序列完好,但生物节律性温度补偿属性表型为温度条件型的蓝藻突变体nktc1(Non-Kai Thermo-regulatory Component 1)。本论文以实验室保存的蓝藻S.elongatus PCC7942的nktc1突变体为对象采取基因工程方法对其温度补偿异常表型的分子机制进行了初步探究。本论文的具体研究内容如下:1.首先基于基因组测序和基因克隆的方法确定了nktc1的突变位点。相关实验结果表明nktc1突变体的准确突变位点是蓝藻基因组中的Synpcc 7942＿0644(即CikA基因)与Synpcc 7942＿0095(即RpaA基因)等2个单碱基置换位点,并且均导致了各自编码产物蛋白的1个氨基酸错义突变。其中被命名为nktc-cik A的突变位点可以导致野生型CikA蛋白中559位Phe突变为Ser;被命名为nktc-rpaA的突变位点可以导致野生型RpaA蛋白中118位Ala突变为Thr。2.接着使用基因工程方法,分别构建nktc-cik A突变位点的单基因突变重构藻株nktc-cik A-m和nktc-rpaA突变位点的单基因突变重构藻株nktc-rpaA-m,以及nktc-cik A突变位点原位回复藻株19T-cik A-R和nktc-rpaA突变位点原位回复藻株19T-rpaA-R,还构建了nktc-cik A突变位点异位回复藻株NS-CikA-R、nktc-rpaA突变位点异位回复藻株NS-RpaA-R和2个突变位点异位组合回复蓝藻株系NS-CikA-RpaA-R等7种转基因蓝藻株系;3.以前述通过基因工程方法构建的7种转基因藻株、野生型蓝藻S149和nktc1为对象,对各蓝藻藻株进行低温驯化处理后,分别利用RT-q PCR和Western blot方法对KaiC基因的表达节律及KaiC蛋白的磷酸化状态节律性进行检测,结果显示:低温驯化处理野生型蓝藻S149、nktc-cik A-m、nktc-rpaA-m及NS-RpaA-R既可以在转录水平上有效驯化中KaiC基因转录的生物钟节律性相位,也可以在翻译后修饰水平上有效驯化KaiC蛋白磷酸化修饰状态的生物钟节律性相位。但是nktc-cik A-m周期长度变短;nktc-rpaA-m与NS-RpaA-R周期长度变长。而蓝藻nktc1、NS-CikA-R、NS-CikA-RpaA-R既不能在转录水平上有效驯化KaiC基因的转录节律性相位,也不能在翻译后修饰水平上有效驯化其KaiC蛋白磷酸化状态的生物钟节律性相位。低温驯化处理19T-CikA-R与19T-RpaA-R藻株并不能牵引KaiC蛋白磷酸化修饰状态的节律性相位,但都可以在转录水平上有效驯化中KaiC基因转录的生物钟节律性相位。其中19T-CikA-R中节律性的周期长度变短;19T-RpaA-R周期长度变长。4.初步分析了CikA和RpaA等2个基因在蓝藻生物节律性温度补偿属性调控中可能的功能。基于现有实验的结果,论文初步确定CikA基因和RpaA基因及其各自对应的表达产物可能通过2条不相同的下游通路影响了S.elongatus PCC 7942生物钟温度调控过程。其中CikA基因可能参与了该种蓝藻生物钟温度调控的负反馈调控过程,而RpaA基因则可能参与了蓝藻生物钟温度调控的正反馈调控过程。