第一部分 供体源性骨髓间充质干细胞诱导异种受体免疫状态变化的实验研究 前言 干细胞显著的生物学特性是既有自我更新的能力又具有多向分化的潜能，可分为胚胎干细胞(ESC)和成体干细胞如造血干细胞(HSC)、骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSC)、神经干细胞、肌肉干细胞、成骨干细胞、内胚层干细胞和视网膜干细胞等。骨髓中除造血干细胞以外，还含有另一类干细胞—间充质干细胞(MSC)。MSC具有很强的自我增殖能力和多向分化潜能。在不同的诱导条件下，具有向中胚层和神经外胚层组织细胞分化的能力，如向成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、内皮细胞、神经细胞及支持造血的基质细胞等分化。许多研究表明，MSC能表达多种表面抗原，可表达间质细胞、内皮细胞、表皮细胞的表面标志。主要有：粘附分子类，生长因子和细胞因子受体，整合素家族成员，MHC—Ⅱ类分子及其共刺激分子B7—1，B7—2，5’末端核苷酸酶等。骨髓间充质干细胞还能分泌IL-6、IL-7、IL-8、IL-11、G-CSF、DSF、SCF等多种细胞因子。 MSC具有容易获得、容易体外培养增殖、长期传代不改变生物学特征、抗原性小、组织修复能力强等特性，在组织工程、细胞因子替代治疗、基因治疗中以及器官移植等方面的应用己得到广泛研究。利用干细胞的多向分化性，选择合适的生物材料和靶向性目的基因，MSC在骨、软骨、肌腱和神经胶质修复中的应用建伟2004年浙江大学博扫开究生学位论文认叭NGJ一an一W亡1 Dissertation for M.D已得到深入研究。目前MSC的免疫调节作用更引起了新的重视。最近的研究结果已证实MSC具有复杂的调节T细胞和B细胞功能的作用。对于在异种受体内环境中引起的免疫状态变化尚无明确的阐述。本实验研究观察体外培养的豚鼠MSC输注大鼠诱导免疫状态的变化，有助于深入阐述MSC的免疫调节功能，丰富移植免疫耐受的诱导策略。 材料和方法 选用健康雄性豚鼠(150一1809)，纯系雄性Wister大鼠(180一2209)。l、MSC的分离、培养 以豚鼠为供体，胫骨离断，自骨髓腔内获取的骨髓标本，采用Percon密度梯度分离取得单个核细胞层，加入L一DMEM培养液，培养传代。 2、表面标志物的检测 取第3代的贴壁细胞悬液，加入荧光标记小鼠抗鼠单抗eD34一FITe/eD45一PE，CD44一FITC，CD29一pE和同型阴性对照小鼠抗小鼠IgGI一FITC和lgGZa，流式细胞仪检测分析。3、定向诱导 MSC向脂肪细胞分化 取第3代的贴壁细胞制成单细胞悬液，加入脂肪细胞诱导液，14d后行油红O染色，光镜观察。4、供体MSC输注受体 取第5代的贴壁细胞悬液，台盼兰染色测定细胞活性>95%时，加入叮睫橙 (AO)染色液，荧光显微镜观察。 以24只雄性Wiste:大鼠为受体，环磷酞胺预处理后随机分为两组:A组为MSC输注组:自大鼠阴茎背静脉注射的MSC单细胞悬液+地塞米松;B组为对照组:自大鼠阴茎背静脉注射生理盐水+地塞米松;每3d一次，共三次。以首次输注前及输注后的12d、15d、18d、21d为时点自两组大鼠阴茎背静脉取血lml。5、受体的免疫球蛋白及补体的变化 自大鼠阴茎背静脉获得血清待测标本，按照Beckinan Coulter IMMAGE分析仪的使用SOP加样检测。6、统计学处理 使用sPsS 10.0统计分析软件，应用单因素方差分析(One一wayANOvA)，以尸<口.口J为差异有统计学意义。L_建伟2004年浙江大学博L研究生学位论文认叭NGJ一an一W已1 Dissertation for M.D 结果1·MSC的分离、培养 PBS洗涤后的骨髓细胞悬液Percoll分离工作液后，分为血小板层、白细胞层和红细胞层。自血小板层中取得单个核细胞培养得到成纤维细胞样外观的MSC，原代培养细胞生长增殖较慢，3一10代的细胞生长周期为4一sd，形态较均一，呈长梭形。10代以后细胞生长速度缓慢，形态扁平，可见核碎裂、核固缩现象，增殖速度明显减慢直至停止。2、流式细胞仪检测MSC表面标志物 培养至第3代的MSC膜表面CD34阴性、CD45阴性、CD44阳性、CD29阳性。3、定向诱导向脂肪细胞分化 从第4一5天起，光镜下观察见淡黄色的脂滴沉着的细胞，形状变为圆形或椭圆形，细胞核可被脂滴挤偏于一侧。油红O染色见脂滴呈红染，胞核呈蓝染。对照组的细胞形态未见变化。4、供体MSC输注对受体的免疫球蛋白及补体的影响 台盼兰染色测定细胞活性>95%时，制成单细胞悬液叮陡橙染色后，荧光显微镜激发观察，在6O4nm波长处可见有活力的细胞胞膜和胞浆呈现红色的明亮荧光，胞核呈均匀的黄色或绿色荧光。 MSC单细胞悬液输注受体后各个时相的抗体IgG、lgM和补体C3较输注前和对照组有显著降低(尸<口.口J)，而IgA和补体C4与输注前相比无明显变化。输注后各个时相的抗体IgG、IgM和补体C3总体上呈回升趋势，但各个时相点之间的变化差异无显著性(尸夕0.口J)。 结论 1、体内环境下低丰度的MSC在体外培养实现数量扩增是可行的?