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神经嵴是脊椎动物胚胎发育早期短暂存在的一个结构,神经嵴细胞经迁移、增殖和分化等过程可发育成多种不同组织细胞,其中包括肠神经节细胞和色素细胞。神经嵴细胞迁移、增殖和分化过程复杂,受多个信号通路调控,涉及多个基因。这些调控基因发生结构变异或表达量的变化均可导致神经嵴细胞来源的肠神经节细胞和色素细胞发育障碍,引发先天性巨结肠症(Hirschsprung’s disease,HSCR)和皮毛颜色异常。HSCR又称无神经节性巨结肠(aganglionic megacolon),是一种可遗传的、人兽共有的肠道发育异常,病因是胚胎发育早期神经嵴细胞分化移行障碍导致肠道神经节细胞缺损,受累肠道节律性收缩蠕动功能异常,肠内容物排出受阻,近端肠管继发性扩张形成。HSCR病因复杂,表型多变,多为散发,不遵守孟德尔遗传定律,被认为是多基因互作的结果。已有的研究结果只能解释部分病例。因此,探寻HSCR未知易感基因和修饰位点或修饰基因具有重要意义。动物皮毛的颜色由神经嵴细胞来源的、黑色素细胞分泌的黑色素种类和数量共同决定。黑色素细胞发育异常不但会引起机体皮毛颜色异常,还被认为与多种人类疾病相关,如恶性黑色素瘤、帕金森病等。黑色素细胞发育过程复杂,受多种信号通路和转录因子的调控,但相关调控机制仍未完全研究清楚。本研究以表型严重程度不同的AGH和LEH两个品系的HSCR大鼠模型为亲本产生F1代,再互交制作F2代群体,在F2代进行HSCR和色素异常相关QTL定位,进一步利用生物信息学分析方法在其置信区间内筛选可能的HSCR和色素异常相关基因,通过对候选基因进行测序分析来寻找在两个大鼠品系中存在的遗传差异,通过载体构建、细胞培养、双荧光素酶报告基因检测系统对相关遗传差异进行功能性分析,进一步研究其修饰HSCR表型的机理。为进一步鉴定两个基因的互作修饰HSCR表型和色素异常表型,本研究还进行了基因敲除细胞株的构建和电穿孔法将CRISPR/Cas9系统中Cas9的mRNA和g RNA的RNA导入小鼠胚胎制作基因敲除小鼠的初步探究。本研究主要得到以下结果:(1)AGH-Ednrbsl/sl大鼠肠神经节细胞缺损严重,LEH-Ednrbsl/sl个体症状较轻,F1-Ednrbsl/sl个体肠神经节细胞缺失程度较AGH-Ednrbsl/sl个体得到缓解,说明在LEH遗传背景中存在与Ednrb互作共同影响肠神经节细胞发育的修饰基因或修饰位点。(2)在大鼠2号染色体(Chromosome,Chr)上定位到一个与HSCR显著相关的qtl位点,最高lrs值(d2mgh14)达25.0,该位点造成的变异占总变异的15%。对于该位点,leh等位基因对hscr表型表现为抵抗作用,agh纯合个体hscr症状最严重,leh纯合个体hscr症状最轻,agh/leh杂合个体hscr症状则介于两者之间。(3)在chr2上的hscr相关qtl位点的置信区间内筛选出三个hscr相关候选基因:slc45a2、gdnf和ptger4。测序发现gdnf基因第一起始密码子上游第613位碱基处存在c/t突变(g.76896910c>t),其中,leh群体为c,agh群体为t。双荧光素酶报告基因检测系统检测后发现该突变位点使agh大鼠gdnf基因启动子活性明显降低。提示agh与leh品系间ednrbsl/sl大鼠肠神经节缺损型存在差异可能归因于gdnf基因与ednrb基因的互作。(4)agh-ednrbsl/sl大鼠毛色几乎全白,leh-ednrbsl/sl大鼠头部有较大一块着色,f1代中ednrbsl/sl个体色素异常症状得到缓解,说明在leh遗传背景中存在与ednrb互作共同影响黑色素细胞发育的修饰位点或修饰基因。(5)在大鼠chr7上定位到一个与色素异常极显著相关的qtl位点,最高lrs值(d7got23)为45.0,该位点造成的变异占总变异的26%,agh纯合个体色素异常程度最严重,leh纯合个体色素异常程度与agh/leh杂合个体色素异常严重程度相当。另外,d7got23位点分别与d14mit4位点及d3rat78位点存在互作效应,共同修饰色素异常表型。其中,在d7got23位点与d3rat78位点上,均是leh等位基因对色素异常存在抵抗作用,而在d14mit4位点上是agh基因型对色素异常存在抵抗作用。(6)在大鼠chr7色素异常相关qtl位点的置信区间内筛选得到3个色素异常相关候选基因:lgr5、wif1和kitlg基因。同线性分析发现该qtl位点与小鼠chr10上一个色素异常相关的qtl位点同源,并且发现已知的毛色异常易感基因kitlg基因位于该区域。在agh和leh品系的lgr5和wif1基因外显子区及上游部分启动子区未发现差异;而在kitlg基因编码区检测到一个错义突变(g.42338824c>t),该突变造成对应氨基酸由脯氨酸变成丝氨酸。在线软件sitf预测该突变可能影响其蛋白质功能。结果提示agh-ednrbsl/sl大鼠与leh-ednrbsl/sl大鼠毛色表型的差异可能归因于kitlg基因与ednrb基因互作。(7)基于crispr/cas9基因编辑技术,分别设计并验证得到用于敲除大鼠/小鼠ednrb基因和gdnf基因的grna,分别为:1)rat-ednrb-grna:gagccggtgcggacg-cgcct;2)rat-gdnf-grna:cgcttcgagaagcgtcttac;3)mouse-ednrb-grna:gagccggtgcggacgcgcct;4)mouse-gdnf-grna:gtctacggagaccggat-ccg。并筛选得到大鼠神经胶质细胞瘤细胞系ednrb基因敲除单克隆细胞株和gdnf基因敲除单克隆细胞株。为后期从细胞水平上研究ednrb(gdnf)基因突变对gdnf(ednrb)基因及其它肠神经节细胞发育相关基因表达的影响及制作ednrb和gdnf基因敲除小鼠奠定基础。(8)体外转录得到crispr/cas9系统组件及egfpmrna。在体外用电穿孔法将罗丹明导入1.5 d小鼠胚胎时,摸索到的最佳条件为:电压110 v,脉冲时间5 ms,脉冲间隔为50 ms,脉冲次数为3。此时,正常发育且成功电转罗丹明效率可达27%。电压过高或过低电转效率均急剧下降。这些结果为后期利用CRISPR/Cas9基因编辑技术制作基因敲除鼠以研究Gdnf与Ednrb基因、Kitlg与Ednrb基因互作影响肠神经节细胞发育和黑色素细胞发育的遗传机制奠定理论和技术基础。