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苯丙氨酸羟化酶(Phenylalanine hydroxylase，简称PAH)(EC1.14.16.1)，是一种非血红素铁酶，负责将苯丙氨酸转化为酪氨酸。人体中PAH代谢故障会导致苯丙酮尿症(PKU)的产生。通过在食物中添加PAH可有效降低血液中苯丙氨酸的含量，是PKU患者治疗的福音。来源于紫色色杆菌的苯丙氨酸羟化酶(CvPAH)结构简单，催化性能接近人类PAH，具有潜在的药用价值。但是，目前尚无系统性的CvPAH酶学性质方面研究的报道。CvPAH的热稳定性较低，是其应用的限制因素。本文在大肠杆菌中克隆表达了紫色色杆菌来源的PAH，对重组酶的酶学性质进行研究，并进行分子改造提高其热稳定性。主要研究结果如下：从紫色色杆菌基因组中PCR扩增，得到苯丙氨酸羟化酶基因pah，并克隆于pET24a载体，构建Escherichia coli BL21(DE3)/pET24a-pah重组表达菌株。其诱导条件优化后确定为：IPTG终浓度为0.6mmol·L-1、24℃诱导24h。蛋白电泳表明，实现了PAH重组酶的高效表达。经离子层析纯化，获得了比酶活高达503.2U·mg-1的重组PAH纯酶。酶学性质研究显示，该重组酶的最适反应温度为40℃左右，50℃时PAH的半衰期为15min；最适pH在7.5左右，在pH6-8范围内较稳定。37℃，pH7.5条件下，Km值为1.5mmo·L-1，Vmax为0.5mmol·min-1，kcat为5.05s-1，催化效率kcat/Km为3.37L(mmol·s)-1。通过谐波动力学手段对紫色色杆菌PAH进行分析，获得具有高柔性的氨基酸位点将这些氨基酸分别突变为刚性氨基酸——脯氨酸。此外，通过引入二硫键提高PAH的热稳定性，构建了半胱氨酸突变体(K16C/W121C、H41C/R76C、V151C/F247C、A168C/Y262C、 K239C/G274C)。其中，脯氨酸突变体D267P和半胱氨酸突变体K239C/G274C在50℃保温10min后残余活性均提高为原始酶的2.5倍。圆二色谱(CD)测得其溶解温度(Tm值)比野生型均提高了5℃以上。同时，两个突变体的催化效率(kcat/Km值)可达与到野生型相当的水平，表明通过两种方法对PAH的热稳定性都形成了有效改造。本研究结果对PAH的理论研究和应用有一定的借鉴意义。