活性氧(Reactive oxygen species，ROS)是细胞有氧代谢过程中或在外界环境的刺激产生的物质，它包括氧离子、过氧化物和含氧自由基等。这些颗粒在机体的正常代谢中持续产生且相当微小。由于存在不成对自由电子，而具有强烈的化学反应活性。通常，体内存在一定的抗氧化物质，如过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)等的作用来减少ROS的过量积累。然而，当体内ROS剧烈增加，与体内抗氧化防御系统之间的平衡遭到破坏，就容易引起氧化应激反应。这种氧化应激表现为DNA链断裂，对膜离子转运系统，酶和其他蛋白质的损害以及脂质过氧化。　　红细胞的寿命大约120天，在此过程中红细胞不断暴露于内源性和外源性的ROS，导致红细胞结构和功能发生改变，直至老化，并最终被从血液循环中清除。红细胞变形性（Erythrocyte Deformability，ED）为其在流体剪切力的作用下穿过狭小的毛细血管提供了可能，而且红细胞的这种重要特性也在维持微血管系统剪切应力增加时有效组织灌注中起着重要作用。红细胞变形性受其结构影响显著，但力学因素对维持红细胞独特的变形性也起着重要作用。此外，有研究表明，红细胞变形性是红细胞生存的主要决定因素。红细胞变形性及其力学性能在临床上的重要性日渐显著，因此氧化应激对其产生的影响也日益引人注目。　　以往有研究对氧化应激如何诱导红细胞结构和功能的变化进行了探讨。氧化应激通过引起红细胞膜蛋白Band3发生改变，导致其流变学性质，变形性以及膜骨架和脂双层的力学性能的功能发生障碍。体外研究表明，红细胞接触氧化剂后，膜蛋白Band4.1结构发生破坏并形成有功能受限的血影蛋白-Band4.1-肌动蛋白三级复合物而使红细胞膜稳定性下降。作为次级抗氧化防御机制，结合于膜上的蛋白酶会通过优先降解发生氧化损伤的蛋白来保护红细胞的结构与功能。　　前文已经提到了当微循环剪切应力增加时，红细胞变形性是维持组织有效灌注量的一个重要的因素。不仅如此，一些研究人员指出，红细胞变形性还是红细胞存活的主要决定因素。在正常情况下，人体红细胞在机械力的作用下具有广泛的变形能力，这使得它们可以穿过宽的毛细血管，甚至可以通过直径比RBC更小的（3-5μm）的狭窄毛细血管。因此，经常有研究报道在微循环疾病中均伴随红细胞变形性的降低，例如，糖尿病并发症。事实上，各种病理生理环境如高血糖可改变RBC的变形性，补充完整，　　基于上述研究，我们知道抗氧化剂对于减小氧化损伤是必不可少的。尽管人体自身存在有效的抗氧化防御系统，但是随着年龄的增长，机体的抗氧化能力下降不足以抵抗发生在关键生物位点的氧化损伤最终导致衰老及与衰老有关的疾病。姜黄素是一种有效的天然抗氧化剂，具有独特的结构，它含有多种官能团，包括β-二酮基，碳-碳双键和含有不同量羟基和甲氧基取代基的苯环。在经过pH改性的基质中用姜黄素对人红细胞进行处理可以防止SO4=吸收的速率常数的降低（SO4=的速率常数已被用作通过Band3蛋白的阴离子转运效率的指标，因为它的测量是更可控的）。红细胞的力学性能，如变形性和膜刚性对红细胞结构与功能是及其重要的，但是目前关于姜黄素对红细胞这一性质的影响的研究还很少，且由于姜黄素对红细胞膜蛋白的保护作用，我们猜想姜黄素可以维持红细胞中的氧化还原平衡并有助于维持其机械性能。　　第一部分---建立红细胞氧化损伤模型并筛选过氧化氢浓度　　在这一部分，我们希望通过筛选适当浓度的过氧化氢(H2O2)来建立一个良好的红细胞氧化损伤模型，模型将在以后的研究中使用。首先，用PBS(pH=7.4)洗涤红细胞三次，2000rpm，2.5min，4℃，并去除上清。将红细胞重悬于PBS(pH=7.4)中以获得不同比容的红细胞悬浮液。实验分为对照组（用PBS处理）和用3种不同浓度的过氧化氢(0.5，4和8mM)处理的测试组。所有组均在37℃温度条件下孵育12h，最后测定红细胞的形态学变化，溶血率和met-Hb水平。同时通过测量红细胞延长指数(EI)以确定细胞的变形性。　　用浓度递增的H2O2（0.5-8mM）处理后，溶血率呈现出剂量依赖性，用8mM H2O2处理组的红细胞溶血率和met-Hb水平显著增加，p值＜0.001。在0.3-30.0Pa剪切应力下红细胞EI值检测中发现，与对照组相比，H2O2处理组均导致红细胞EI值下降，而4mM和8mM H2O2处理组EI值显著下降(p值＜0.001)。但是在使用三种不同浓度的H2O2来诱导RBC的氧化应激时，各组中仅浓度是8mM H2O2组表现出显著的差异性。棘突状细胞的出现，溶血率和met-Hb水平的升高以及EI的下降证明H2O2对红细胞有一定程度的氧化损伤。　　第二部分---姜黄素对过氧化氢诱导的氧化应激时变形能力的影响　　本实验主要考查姜黄素对过氧化氢诱导的红细胞氧化应激的保护作用。首先，将样品分为对照组（用PBS处理），氧化组（用8mM H2O2处理），测试组(用三种不同浓度的姜黄素提取物预处理30分钟：浓度分别为1μM，10μM和20μM)和阳性对照组(用三种不同浓度的维生素C预处理30分钟:1μM，10μM和20μM)。所有组均在37℃条件下孵育12小时。最后测定红细胞溶血率，met-Hb水平，CAT活性，SOD活性，GPx活性和脂质过氧化程度。由于红细胞结构的轻微改变也会影响红细胞的变形性，因此将探索红细胞特性的重要参数：红细胞的伸长指数(EI)和表征细胞刚度的参数杨氏模量。红细胞抗氧化能力研究结果表明:在氧化损伤过程中，红细胞将启动第一级抗氧化反应机制，主要的抗氧化酶包括SOD、CAT和GPx。此外，红细胞将消耗大量的GPx用于去除细胞内和外源性ROS。H2O2的去除是通过两个主要途径介导的:GPx依赖型谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶。氧化应激时，红细胞膜脂质发生过氧化，Hb自氧化加速，进一步氧化生成可与细胞膜结合的高铁血红蛋白。用姜黄素提取物或维生素C预处理表现出对红细胞的变形性和机械性能的潜在保护作用。从EI和杨氏模量值，我们可以得出的结论是，姜黄素可以通过机体的第一级抗氧化防御机制来保护其机械性能。　　第三部分---姜黄素对过氧化氢诱导的氧化应激时红细胞蛋白带3的影响　　带3蛋白是红细胞膜上含量丰富且被广泛研究的一种蛋白。它在促进红细胞膜上的阴离子转运中扮演重要的角色，而且也是细胞骨架和很多蛋白的重要结合位点。由于红细胞对ROS非常敏感，因此，揭示ROS对带3的影响引起了研究者们的广泛兴趣。　　在本部分中，首先将样品分为对照组（用PBS处理），氧化组（用8mMH2O2处理），测试组（用三种不同浓度的姜黄素提取物预处理30分钟：浓度分别为1μM，10μM和20μM）和阳性对照组（用VitC预处理30分钟）。所有组均在37℃条件下孵育12小时。然后，在加入和不加入DTT的两种情况下进行SDS-PAGE和Western Blot实验，以阐明过氧化氢诱导的氧化应激是否引起带3的改变。最后，进行免疫荧光染色以观察3蛋白是否发生交联现象。　　从SDS-PAGE和Western Blot实验中，我们发现过氧化氢诱导的人红细胞氧化应激引起带3蛋白质的交联，这可以通过出现于α和β血影蛋白条带上方的新的高分子量(High Molecular Weight，HMW)蛋白质条带看出。然而，在DTT孵育的情况下，HMW带显著降低，这表明高聚物的形成可能是由于带3蛋白巯基交联导致的。同时带3蛋白的交联还显著降低了其运输阴离子的能力。本实验中，我们发现姜黄素通过降低HMW的形成，减少带3的交联而保护氧化应激条件下带3蛋白结构与功能。免疫荧光染色结果表明姜黄素可以减少带3的交联，恢复带3蛋白的正常结构。维生素C也表现出对红细胞氧化应激的改善作用，但与姜黄素处理组相比，我们仍可以看到红细胞膜上带3蛋白荧光聚集体较多，这表明姜黄素的抗膜蛋白交联作用较维生素C强。但是，姜黄素对带3蛋白的作用机理还不是特别清楚，还有待进一步的研究。　　总之，这项研究表明，姜黄素对过氧化氢诱导的红细胞氧化应激损伤具有一定的保护作用，能有效的维持氧化应激条件下红细胞的正常结构和变形能力。