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细胞骨架结构发生改变可以导致听觉功能障碍,常见的有Usher综合症等。在细胞骨架的重组过程中,MLCK基因扮演了重要的角色。肌球蛋白具有促使肌动蛋白转运的功能,而肌球蛋白的磷酸化及重组都需要MLCK基因作为激酶的参与。基于以上的理论,我们构建了一种内耳毛细胞MLCK基因特异性敲除的小鼠模型来观察MLCK基因在内耳声音传导方面的作用。通过对基因敲除小鼠的ABR检测,结果显示,在4K、8K、16K的纯音刺激下,基因敲除小鼠的听阈较对照小鼠上升了20dB(p<0.05)。通过进一步的扫描电镜观察,我们发现在内毛细胞的表皮板上出现了泡状突起,但是在透射电镜这种表现观察的不是很明显。通过这些检测结果,证明了MLCK基因可能在内耳的声音传导过程中起到一定的作用。本实验对MLCK对内毛细胞的作用进行了初步研究。包括一下三个部分。
第一部分模型构建及敲除效率检测
在应用模型进行MLCK基因功能研究前,我们首先要确定该模型的可靠性和敲除基因的准确性。只有在确定动物模型成功建立后,才能够保证接下来的功能学和形态学研究最终结果的科学性。免疫组织化学荧光显示在新生的KO小鼠内耳毛细胞内有强烈的荧光显色,而野生小鼠内毛细胞内没有检测到荧光信号。这证明了在小鼠内毛细胞的确没有基因的表达,耳蜗内毛细胞特异条件基因敲除小鼠动物模型成功建立。
第二部分内耳形态学观察-扫描电镜和透射电镜
在成功验证了实验小鼠的敲除效率之后,就要进行形态学的相关研究来获得引起这种表型变化的形态学和病理学相关信息。在这一部分中,我们应用了电子显微镜来详细评价动物模型耳蜗内的结构变化,电镜结果显示MLCK基因敲除小鼠的内毛细胞发生了明显的病理改变,扫描电镜观察发现内毛细胞表皮板附近有球状突起,透射电镜观察发现内毛细胞胞体内出现空泡样改变,这可能与细胞骨架改变有关。这和MCK在细胞内的作用机制存在一定的关系。
第三部分听功能检测
探究基因在内耳发育是否发挥作用,首先要了解动物模型的听力表型特征。在本研究中对内毛细胞特异性条件基因敲除小鼠我们进行了听觉脑干反应(ABR)检查。检查结果显示,野生型(8只)和敲除小鼠(6只)在click刺激下都可正常引出波形,并无显著区别。而在4kHz,8kHz,16kHz,32kHz纯音刺激下,野生型和纯合型小鼠的ABR阈值差异具有统计学意义。