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苋菜（Amaranthus tricolor L.）是石竹目苋科苋属一年生草本植物,茎和叶富含甜菜色素,因具有清除氧自由基、抗氧化、抗衰老、抑癌及着色能力好等作用被广泛应用于医药、化妆品及食品中。甜菜色素的合成不仅受内在遗传物质的影响,也受到温度、激素、光照和机械损伤等外界信号的影响,但外界信号调控甜菜色素代谢的分子机制尚不清楚。DELLA蛋白是植物对各种环境信号和激素信号系统反应的整合因子,研究DELLA蛋白基因对甜菜色素代谢的影响具有重要意义。本研究以‘大红’苋菜为试验材料,克隆出了苋菜DELLA蛋白基因AtGAI并对其进行生物信息学分析;探究了GA3、PP333及温度是否通过调控AtGAI基因的表达进而调控苋菜幼苗生长及甜菜色素代谢;最后采用VIGS技术进一步验证苋菜AtGAI基因的功能,以期为深入研究GAI基因对甜菜色素代谢机制的调控奠定基础,也为将来苋菜栽培中的环境调控提供理论参考。1苋菜AtGAI基因的克隆与生物信息学分析采用RT-PCR结合RACE技术从‘大红’苋菜中克隆出GAI基因c DNA全长序列,命名为AtGAI,全长为2 168 bp,含有一个1 818 bp的开放阅读框,编码605个氨基酸。生物信息学分析表明,苋菜AtGAI蛋白与其他物种GAI蛋白具有高度相似性,含有DELLA和GRAS两个保守结构域。进化树分析表明,苋菜AtGAI蛋白与籽粒苋GAI蛋白亲缘关系最近,且与石竹目植物聚为一个分支。综上所述,苋菜AtGAI基因是GAI家族成员且在生物进化过程中具有保守性,可能与其他植物中的GAI蛋白具有类似功能。密码子偏好性分析表明:苋菜AtGAI基因密码子偏好性符合双子叶植物对密码子的使用特性,且与亲缘关系较近的物种使用偏好性相似,密码子偏好性主要受碱基突变的影响,但也受自然选择等其他因素的影响;酵母真核表达系统更适用于苋菜AtGAI基因异源表达,甜菜是苋菜AtGAI基因最理想的遗传转化受体。2 GA3或PP333对苋菜幼苗生长及甜菜色素合成相关基因表达的影响通过对不同激素处理的苋菜组培苗和盆栽苗进行形态观察发现:GA3浓度与株高净增长量呈正相关,与植株红色程度呈负相关;PP333浓度与株高净增长量呈负相关与植株红色程度呈正相关;不同培养条件下,苋菜幼苗对外源GA3和PP333的敏感程度不同。显微观察及甜菜色素含量测定发现,甜菜色素主要分布于苋菜子叶和下胚轴的表皮及维管束鞘周围的薄壁细胞中,甜菜色素含量与GA3浓度呈负相关,与PP333浓度呈正相关。内源激素含量测定发现:外源GA3处理使内源GA3和IAA含量升高;外源PP333使内源IAA含量下降,使内源GA3含量略有升高但未出现显著差异。qPCR分析表明,苋菜组培苗子叶和下胚轴中AtGAI、Am MYB1、Am CYP76AD1、Ama DODA基因表达量与GA3浓度均呈负相关,且存在部位差异性。综上所述,AtGAI基因可能通过响应GAs信号参与调控苋菜幼苗生长及甜菜色素代谢。3温度处理对苋菜幼苗生长及甜菜色素合成相关基因表达的影响对7 d幼苗进行不同温度及不同时间处理。形态观察发现:不同温度处理3 d后,植株颜色差异较显著,15℃、20℃和40℃处理下苋菜幼苗中的红色变淡;处理6 d后,40℃处理下的幼苗细长、子叶闭合,25℃和30℃处理下的幼苗长出第1片真叶,15℃、35℃和40℃处理下苋菜幼苗中的红色变淡。甜菜色素含量测定发现,温度与甜菜色素含量呈倒U形曲线关系,25℃时最高,30℃和25℃未出现显著差异,且处理6 d的变化程度比3 d更明显。说明,温度是影响‘大红’苋菜幼苗形态的重要环境因子,最适温度范围为℃。qPCR分析发现,不同温度处理3 d后和6 d后,苋菜幼苗中AtGAI、Am MYB1、Am CYP76AD1和Ama DODA基因表达量基本呈现先上升后下降的趋势,处理时间越久变化趋势越明显。综上所述,温度可能通过调控AtGAI基因的表达来调控苋菜幼苗生长及甜菜色素代谢。4苋菜AtGAI基因的功能分析采用VIGS技术来进一步验证苋菜AtGAI基因在苋菜幼苗生长及甜菜色素代谢中的作用。表型观测发现,Uninoculated、p TRV1/p TRV2-empty和p TRV1/p TRV2-AtGAI 3组处理间,株高存在显著差异,且呈现高和矮两种株型。AtGAI基因表达水平检测发现,p TRV1/p TRV2-empty组及p TRV1/p TRV2-AtGAI组中较高植株显示阳性,较矮显示阴性,阳性率约为60%,基因沉默率约为17%。甜菜色素合成相关基因表达水平检测发现:对于AtGAI、Am MYB1和Am CYP76AD1基因而言,与Uninoculated组相比,接种p TRV1/p TRV2-AtGAI使基因表达量下降,接种p TRV1/p TRV2-empty使基因表达量升高;对于Ama DODA基因而言,与Uninoculated组相比,接种p TRV1/p TRV2-empty和接种p TRV1/p TRV2-AtGAI后基因表达量都下降,但接种p TRV1/p TRV2-AtGAI后基因表达量下降更明显。进一步说明,苋菜AtGAI基因可能通过调控甜菜色素合成关键基因Am MYB1、Am CYP76AD1和Ama DODA的表达进而调控甜菜色素代谢。对接种2周时的苋菜植株喷施外源GA3处理4 d后发现,与Uninoculated组相比,p TRV1/p TRV2-empty组株高净增长量略低,差异显著但未达到极显著水平,而p TRV1/p TRV2-AtGAI组株高净增长量较高且出现极显著差异。说明,将AtGAI基因部分沉默后,再喷施外源GA3植株生长更快,可能是由于此时AtGAI蛋白的阻碍作用减弱。