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儿童恶性血液病占儿童恶性肿瘤的首位，而造血干细胞移植对于许多恶性血液病来说是一种标准的治疗方法，也是唯一可以有效治愈恶性血液病的方法。目前儿童血液病主要采用化疗及造血干细胞移植进行治疗。对于部分儿童恶性血液病，如儿童急性淋巴细胞白血病，通过化疗可使85%的患者长期生存，但对于其它的急性髓性白血病、高危急性淋巴细胞白血病、难治复发白血病等，化疗均不能使患者长期生存，而需进行异基因造血干细胞移植。而异基因造血干细胞移植最大的优势是可通过大剂量的化疗预处理方案一次性、大量清除体内的肿瘤细胞，并且移植后通过移植物抗白血病(GVL)效应清除体内残留的极少量肿瘤细胞，最大程度的减少复发机率，但其同时也因异基因来源的供者细胞而产生相应的移植物抗宿主病(GVHD)，影响受者的生存质量，甚至危胁生命。而在儿童造血干细胞移植中，我们选择的供者很大一部分来自于父母，父母作为供者即所谓的单倍型造血干细胞移植，这类移植由于HLA配型仅有一条单倍体相合，移植后的植入失败率及GVHD发生率均明显高于HLA相合的异基因造血干细胞移植。目前研究发现使用脐血细胞作为第三方细胞辅助输注在单倍型造血干细胞移植中的免疫耐受效果较好，可有效减轻异基因造血干细胞移植后的GVHD发生率及严重程度，但其具体机制仍未可知。本研究旨在通过建立小鼠造血干细胞移植模型，进而探讨脐血细胞作为第三方细胞辅助输注在单倍型造血干细胞移植中的免疫耐受效果及机制。本研究通过CFSE标记的人源脐血细胞作为单倍型造血干细胞移植的第三方细胞，从而有利于进行体内示踪，分析脐血进入受者体内后的分布及分化情况。在回输前进行CFSE标记效果有相关实验，将CFSE进行细胞染色时的终浓度分别设定为5umol、10umol、15umol、20umol、25umol、30umol，进行细胞培养，每10d在荧光显微镜下观察细胞的荧光颜色及检测细胞活率。分析结果认为CFSE对脐血细胞的标记效果好，操作简单、易行，非细胞成分不易被染色，有效降低假阳性率；荧光显微镜下的CFSE荧光强度为浓度依赖型，易于根据实验需要进行荧光强弱的调整；CFSE荧光在+10d、+20d时仍明显可见，可主观明确辨识与其它可能存在的干扰光的区别，可满足本实验的要求；随CFSE终浓度增高而细胞活率逐渐下降，认为可能与CFSE为30umol终浓度时细胞毒性增大有关，其余CFSE中低终浓度对于脐血细胞是完全可以耐受的；综上分析认为适合本实验的最佳CFSE标记终浓度为20umol。本研究以小鼠aGVHD模型为依托，使用BALB/C雌鼠作为aGVHD模型的受鼠，使用BALB/C雌鼠与C57雄鼠的F1代，即CB6F1小鼠中的雄性小鼠作为供鼠。所有小鼠均为SPF级小鼠并饲养于SPF级动物房内。采集供鼠骨髓+脾脏细胞按1:1比例混合成供鼠干细胞后备用，受鼠经8.0Gy Co60照射后实验组分别回输经CFSE标记的脐血细胞+供鼠干细胞，对照组仅回输供鼠干细胞。回输后观察两组小鼠的表现及反应，并每周进行血常规及流式细胞术检测T-reg细胞比例，每周采集小鼠的皮肤、肝脏、小肠进行病理检查。从临床aGVHD评分及病理aGVHD表现来看，实验组小鼠在辅助输注第三方脐血细胞的单倍型造血干细胞移植后，从移植后的各时间点(+7d、+14d、+21d、+28d、+50d)的aGVHD评分来看，实验组aGVHD的发生率(P <0.05)及严重程度(P <0.05)均显著低于对照组。而病理结果亦表明，实验组小鼠的aGVHD靶器官（皮肤、肝脏、小肠）发生aGVHD的发生率及严重程度明显低于对照组。通过CFSE追踪脐血细胞发现，小鼠血液内的CFSE标记的脐血细胞在较短时间内消失，但可于aGVHD的靶器官(小肠、肝脏)的局部组织的冰冻切片上发现CFSE标记的脐血细胞，提示部分或全部脐血细胞进入到了aGVHD的靶器官，推测其可能其在局部发挥了某些作用，从而降低了实验组的aGVHD发生率及严重程度。从两组小鼠的植入数据分析发现，两组小鼠平均在+7d内WBC植入，实验组小鼠在+14d时WBC明显高于对照组(P <0.05)，即可认为+7d前两组小鼠WBC无显著性差异(P>0.05)，但在+7d~+14d时实验组小鼠白细胞恢复早于对照组，可见移植后早期实验组外周血WBC恢复要快于对照组。而实验组小鼠的PLT在+7d、+14d的恢复要明显快于对照组(P <0.05)，但移植后期(+21d、+28d、+50d)两组小鼠PLT恢复水平相当(P>0.05)。检测移植后不同时间点两组小鼠体内T-reg细胞数量的变化情况发现，实验组小鼠在+7d、+28d时T-reg细胞明显多于对照组小鼠的T-reg细胞数量(P <0.05)，而其它时间点(+14d、+21d、+50d)两组的T-reg细胞未见显著性差异(P>0.05)。从两组小鼠移植后长期生存时间上比较，两组小鼠并无显著性差异(P>0.05)，即意味着使用第三方脐血细胞输注辅助的单倍型造血干细胞移植不能提高小鼠的长期生存率及生存时间。由此可见，但脐血作为第三方细胞辅助输注的干细胞移植可有效促进早期造血恢复，使WBC、PLT早期恢复更快以减少出现感染、出血等移植相关并发症的风险，并减轻小鼠aGVHD，无论从临床表现上或是从病理表现上均可明显减轻小鼠aGVHD靶器官的反应。而aGVHD靶器官内发现的CFSE标记的脐血细胞可能提示了第三方脐血细胞进入到局部aGVHD靶器官，并通过某些机制发挥了保护作用从而减轻了局部的aGVHD表现。而移植后两组小鼠体内T-reg细胞的数量差异提示可能由于第三方脐血细胞通过某种机制调节小鼠体内产生更多有效的T-reg细胞从而诱导了免疫耐受，以减轻全身及局部靶器官的aGVHD反应。使用脐血作为第三方细胞辅助输注的造血干细胞移植不能延长小鼠的长期生存率及生存时间，考虑生存率及生存时间受多种因素影响，增加脐血辅助输注目前暂未见到其对这两项指标的影响。