类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis, RA),是临床风湿免疫科的一个常见病、多发病。1858年英国医生加罗德首先提出类风湿性关节炎这一病名,RA是一种以关节滑膜病变为主的慢性、全身性疾病,主要表现为关节滑膜炎,其次为浆膜、心肺、皮肤、眼、血管等结缔组织广泛性炎症,造成关节各种组织如软骨、韧带、肌腱、骨髓和多脏器损害。滑膜炎可反复发作,导致关节软骨及骨质破坏,最终导致关节畸形及功能障碍。RA现已为世界公认的难治性疾病,据国外资料,其发病率占人群1%左右,据1984年东北、北京及汕头等地调查、其发病率在0.24%～0.5%左右。RA发病范围广,好发年龄为20～45岁,80%发病于35～50岁,女性发病率高于男性,女性与男性的发病率之比约为2～4：1,其发病机制目前还不完全清楚,可能与生活环境、细菌、病毒、自身免疫、遗传、性激素等因素有密切关系。在祖国医学中,类风湿关节炎属于“痹证”的范畴,又有“骨痹”、“肾痹”、“历节”、“顽痹”、“尪痹”等别称。RA已成为现代社会生活中常见的疾病之一,严重影响着患者的生存质量,是一种致残率高、危害人类健康的难治性常见多发病。1目的以中医学“天人相应”的整体调控思想为指导,以“肾应冬”为切入点,从褪黑素高位调节的角度,通过动物实验探讨类风湿性关节炎(属中医“痹证”范畴)肾虚型与季节变化的相关性,深层次地揭示肾虚型痹证的物质基础及“五脏应时”的科学性,为中西医结合治疗痹证提供实验依据和分子水平方面的新靶点,改善痹证患者的生活质量。2方法2.1理论研究以古代文献及近年有关类风湿性关节炎(痹证)的中西医研究结果作为依据,佐证季节变化与痹证肾虚型发病存在的相关性。从痹证发病的本质、中医肾与季节变化的关系及痹证发病的时藏关系作为论点,以古代理论文献与现代研究结果相结合,说明痹证肾虚型与季节变化存在着相关性。2.2实验研究2.2.1设计思路以冬至日、夏至日作为切入点,通过实验研究观察季节变化对类风湿性关节炎(痹证)肾虚型CD4+CD25+调节性T细胞表达的相关性影响。2.2.2研究方法本课题采用与人类RA临床特征最为接近的胶原诱导型关节炎(collagen II-induced arthritis, CIA)大鼠模型,基于“天人相应”的中医理论指导,从整体角度来研究季节气候因素对痹证发病情况与病情、病理环节的影响。以冬至日、夏至日两个时间点,观察各组大鼠的关节炎指数,测定各组大鼠血清中CD4+CD25+Treg/CD4+Treg及细胞信号转导指标、褪黑素含量变化,并对大鼠膝踝关节组织进行病理学观察。3结果3.1理论研究中医学认为痹证(RA)发生与风寒湿邪和正气不足相关,感受外邪是痹证发生发展的外部条件,正虚是致病的内在因素,起决定性作用。肾虚是痹证发病的重要内因。人体是一个以五脏为中心的有机整体,在机体内部保持自我动态平衡的同时,与外部环境也在不断的进行着物质与信息的交换,人体与外界同样保持着动态的平衡关系。现代研究已证实,“肾应冬”的科学性,季节对中医肾之机能的正常运行发挥存在着影响关系。基于“肾主骨生髓”、“通于冬气”的时藏理论基础,经过大量临床或实验研究,证明肾虚、冬季与痹证的发病发展存在着千丝万缕的联系。3.2实验研究3.2.1痹证模型复制情况基于病症结合的思路,使用II型胶原复制出类风湿性关节炎CIA模型,与切除性腺(双侧卵巢或睾丸)的方法相结合,复制痹证肾虚型模型。在喂养观察中发现,经过切除性腺的痹证大鼠与其他模型组相比,双后肢关节肿胀更加严重、甚至变形,而且伴随精神萎靡,反应迟钝,倦怠蜷缩,大量脱毛及便溏现象。符合中医肾虚表现症状,说明成功模拟了中医痹证肾虚型模型。从各实验的冬夏季节发病率结果可见,冬季CIA模型组及伪手术组大鼠的发病率均高于夏季组,手术组的冬季发病率比夏季率高,但差异没有CIA模型组与伪手术组显著。原因在于手术组已摘除松果腺,失去了表达机体与自然界节律性的媒介。说明痹证发病或加重多见于冬季；并佐证了‘松果腺-褪黑素’为机体自然节律性表达的重要器官。3.2.2病理形态学观察与CIA模型组、伪手术组相比较,手术组大鼠的膝、踝关节滑膜结缔组织严重增生变厚,或增生的软骨下结缔组织布满关节腔隙,甚至与两侧关节软骨表面相连,使关节腔变窄。关节软骨边缘不整,在关节腔内可见剥落的关节软骨及增生的滑膜结缔组织。骨髓腔扩大情况最为严重,腔中的骨髓数量也大大减少,并见大量炎性细胞浸润,细胞核不规范,肥大细胞消失,脂肪细胞罕见,骨髓腔明显扩张,或有钙化点形成。以上均说明肾虚加重了类风湿性关节炎病变骨关节的破坏,致使RA症状加重,是痹证严重发病、发展的重要内因。从季节变化分析,CIA模型组和伪手术组大鼠膝、踝关节的病理破坏程度,冬季组较夏季组关节破坏的更为严重。说明季节变化影响着痹证病情的发展。手术组大鼠膝、踝关节病理形态破坏程度虽重于CIA模型组及伪手术组,但冬夏两季的比较中手术组变化并不明显,原因在于摘除松果腺后,使手术组大鼠本身无法对季节的节律性改变作出反映而产生差异的不显著。3.2.3CD4+CD25+调节性T细胞的表达与正常组大鼠相比,CIA模型组、手术组及伪手术组CD4+CD25+Treg/CD4+Treg水平均明显降低,并且差异具有统计学意义。说明类风湿性关节炎可导致treg水平降低。在季节性比较中,冬季正常组、CIA模型组及伪手术组大鼠treg水平明显低于夏季组,且差异具有统计学意义。因为松果腺的摘除,手术组冬夏季节treg水平没有呈现出差异。结果表明treg水平的改变具有自然节律性,机体冬季的免疫能力低于夏季,正与冬季阳气藏于内的中医理论相一致。3.2.4痹证大鼠血清IL-1β、IL-6含量变化CIA模型组、手术组及伪手术组大鼠的IL-1β、IL-6含量较正常组都有不同程度的升高,其中手术组明显高于CIA模型组和伪手术组,且各组差异均具有统计学意义。实验证明性腺切除导致肾虚的产生,细胞因子IL-1β、IL-6水平也随之增高,炎症反应加剧,加重了类风湿性关节炎的病情发展,所以肾虚是痹证发生发展的根本。在冬夏季节比较中,冬季CIA模型组及伪手术组与夏季此二组的IL-1β、IL-6含量相比较,均有明显增高,且差异具有统计学意义。实验说明痹证中IL-1β、IL-6水平总体呈现冬高夏低的趋势,体现出中医“肾通冬气”的时藏理论。3.2.5褪黑素(MT)含量变化四个实验组的血清MT水平各有不同。与正常组相比,CIA模型组与伪手术组的MT水平明显升高；手术组较正常组、CIA模型组及伪手术组MT含量明显降低。各实验组产生的差异均具有统计学意义。说明松果腺合成分泌的MT,间接的加重了RA的发病和恶化,证明褪黑素与RA发病之间存在着密切联系。对于冬夏两季的MT水平测定结果,与夏季相比,在冬季的生理组、CIA模型组与伪手术的血清MT含量明显增多,差异具有统计学意义；手术组的血清MT表达,冬夏季节比较无明显差异。MT水平呈现出冬高夏低趋势,存在与自然相统一的节律周期性,符合中医天人相应理论。4结论综合上述结果可知：①使用1I型胶原+切除性腺(双侧卵巢或睾丸)方法成功复制出痹证肾虚型模型；且痹证在冬季发病率高于夏季；‘松果腺-褪黑素’是机体自然节律性表达的重要器官。②从病理形态学及各组膝、踝关节破坏半定量分析结果观察,手术组的关节破坏最为严重,证明肾虚加重了类风湿性关节炎病变骨关节的破坏,致使RA症状加重,符合“肾主骨,生髓”的中医理论,是痹证严重发病、发展的重要内因。冬季组CIA模型组和伪手术组大鼠膝、踝关节的病理破坏程度较夏季组关节破坏的更为严重。说明季节变化影响着痹证病情的发展。冬夏两季手术组大鼠膝、踝关节病理改变并不明显,原因在于摘除松果腺后,使手术组大鼠本身无法对季节的节律性改变作出反映而产生差异的不显著。③各痹证模型组较正常组大鼠CD4+CD25+Treg/CD4+Treg水平均明显降低,说明类风湿性关节炎可导致treg水平降低。冬季正常组、CIA模型组及伪手术组大鼠treg水平明显低于夏季组,呈现夏高冬低的趋势,说明treg水平的改变具有自然节律性,机体冬季的免疫能力低于夏季,这与冬季阳气藏于内的中医理论相一致。④IL-1β、IL-6与RA发病情况成正相关性,是提示RA发病的诊断指标。手术组的IL-1β、IL-6水平明显高于其他两模型组,证明肾虚是导致痹证发生的根本内因。CIA模型组和伪手术组的IL-1β、IL-6含量总体呈现冬高夏低的趋势,说明RA可能多于冬季发病或加重。⑤痹证大鼠MT水平高于正常组大鼠,说明MT对于RA有促进作用,加速了RA的发生发展。且除摘除松果腺的手术组外,其余各组大鼠MT含量总体呈现冬高夏低的趋势,说明‘松果腺-褪黑素’是机体反映自然季节节律变化的重要标志,证明了中医天人相应理论的科学性。综上所述,本实验基于理论研究及实验研究,从冬夏季节四个实验组的模型复制、膝踝关节的病理形态学改变、CD4+CD25+调节性T细胞、细胞因子水平及褪黑素的分泌几方面出发,证实了肾虚-痹证、机体-季节-痹证、机体-松果腺(褪黑素)-季节、痹证-季节-调节性T细胞各部分存在着相应性,可为进一步研究类风湿性关节炎的发病机制及临床治疗提供新的佐证和基础。