论文部分内容阅读
2型糖尿病是最为常见的糖尿病类型,占糖尿病患者人数90%以上。胰高血糖素样肽1（GLP-1）是一种小肠L型细胞所释放的的天然肠促胰岛素激素,能有效降低血糖,促进胰腺β细胞增殖,防止β细胞凋亡和延迟胃排空,在2型糖尿病的治疗中具有良好的前景。然而,天然GLP-1在体内易被二肽基肽酶4（DPP-4）降解,使半衰期仅为1至2分钟,限制其临床上的直接应用,因此开发更稳定的GLP-1类似物或缓释制剂成为了近年来的研究热点。利拉鲁肽是销量最好的酰化的人GLP-1类似物之一,与内源性人GLP-1（7-37）具有97%的同源性,并具有良好的降糖效应。虽然利拉鲁肽的半衰期可达13小时,但仍需要一天注射一次,为了提高患者的顺应性和提高利拉鲁肽的疗效,因此有必要研究长效化多肽药物。我们旨在制备利拉鲁肽纳米制剂,先通过基因工程制备利拉鲁肽的前体,再通过化学修饰制备利拉鲁肽,最后通过纳米粒包埋利拉鲁肽。利拉鲁肽的前体,即GLP-1R34,多使用多肽固相合成方法以制备利拉鲁肽前体。而在我们的研究中应用了一种新方法,其中包括在大肠杆菌中将MFH-GLP-1R34融合蛋白通过乳糖诱导并以包涵体形式表达,GLP-1R34的纯化以及在GLP-1R34 26号位通过谷氨酸介导接上棕榈酸侧链。该载体蛋白有助于利拉鲁肽前体的过表达,与IPTG诱导的表达相比,乳糖诱导的表达对细胞显示无毒性作用,且表达量相当。通过优化乳糖浓度、诱导时间、初始诱导细胞光密度值和培养基条件进行发酵罐培养融合蛋白,并通过分批补料最终获得了10 g/L的菌体量。通过离子交换色谱法成功地纯化了利拉鲁肽前体,获得90%以上的纯度,并通过HPLC进行分离。我们的研究结果表明,通过离子交换制备利拉鲁肽前体的工艺是经济又有效的。通过乳化溶剂蒸发法制备了聚乙醇酸羟基乙酸（PLGA）纳米粒,并优化了制备PLGA纳米粒的工艺,包括溶剂、乳化剂浓度、稀释比例,最终得到了均匀、粒径小、稳定性高的纳米粒,并将其用于后续生物学活性实验。综上,本研究采用大肠杆菌作为利拉鲁肽前体表达的宿主菌,相比传统方法中在酿酒酵母中表达利拉鲁肽前体要更加经济,采用离子交换方法纯化利拉鲁肽前体要更加简便高效,并探索了PLGA纳米粒的制备工艺,为长效GLP-1类似物药物的开发奠定了基础。