论文部分内容阅读
亮氨酸(Leucine,Leu)是调控骨骼肌蛋白质周转代谢的一种支链氨基酸,对骨骼肌生长发育具有重要的调控作用。Micro RNA-27a(miR-27a)在骨骼肌生长发育中也发挥了重要的调控作用。研究表明,营养素可调控内源micro RNA的表达,从而发挥生物学功能。而Leu与miR-27a在猪成肌细胞分化和肌纤维类型转化上的作用目前尚未见报道,且Leu是否通过miR-27a调控猪肌纤维类型转化也并不清楚。为此,本研究旨在考察Leu与miR-27a对猪成肌细胞分化和肌纤维类型转化的影响,并探究其潜在的机制。本研究包括以下五个试验:试验一Leu对猪成肌细胞分化的影响及机理本试验中,在猪成肌细胞诱导分化的同时外源添加不同浓度Leu处理3天,探究Leu在猪成肌细胞分化中的作用。并进一步在添加Leu同时利用阻断剂渥曼青霉素(Wortmannin,WM)干扰Akt活性,研究Leu对猪成肌细胞分化的调控作用是否通过Akt/FoxO1信号通路实现。结果发现,添加Leu促进肌管形成,显著提高肌酸激酶(Creatine kinase,CK)活性,此外,Myogenin和Myo D的m RNA及蛋白表达水平均显著提高。添加Leu显著提高P-Akt/Akt、P-FoxO1/FoxO1的水平,降低FoxO1的蛋白表达量。此外,Leu处理提高了miR-27a的表达。而在添加Leu的同时用WM处理细胞,发现Leu对猪成肌细胞分化的促进作用被WM显著抑制。上述结果表明,Leu通过激活Akt/FoxO1信号通路促进猪成肌细胞的分化。试验二Leu对猪肌纤维类型转化的影响及机理本试验中,在猪成肌细胞诱导分化3天后用不同浓度Leu处理4天,探究其对猪肌纤维类型转化的影响。并进一步用WM干扰Akt活性研究Leu是否通过Akt/FoxO1信号通路调控猪肌纤维类型转化。结果发现,Leu显著增加MyHCI、MyHCIIa、MyHCIIx mRNA及慢肌蛋白表达水平,显著降低快肌蛋白的表达水平。此外,Leu显著提高P-Akt/Akt、P-FoxO1/FoxO1的水平,显著降低FoxO1的蛋白表达和miR-27a的表达。在添加Leu的同时用WM处理细胞,发现阻断Akt/FoxO1信号通路显著抑制Leu对猪肌纤维类型转化的影响。上述结果表明,Leu通过Akt/FoxO1信号通路促进猪肌纤维类型由快肌向慢肌转化。试验三Mi R-27a对猪成肌细胞分化的影响及机理本试验采用脂质体转染方法,探究过表达及干扰miR-27a表达对猪成肌细胞分化的影响,并进一步用WM及miR-27a inhibitor同时处理细胞,研究miR-27a是否通过Akt/FoxO1信号通路调控猪成肌细胞分化。结果发现,过表达miR-27a抑制肌管形成,显著降低Myogenin和Myo D的m RNA及蛋白表达水平,显著提高Myostatin的m RNA表达水平,而抑制miR-27a表达得到相反的结果。此外,过表达miR-27a显著降低P-Akt/Akt、P-FoxO1/FoxO1的水平,显著提高FoxO1的蛋白表达,而抑制miR-27a表达时结果相反。在转染miR-27a inhibitor同时用WM进行阻断发现,WM削弱了抑制miR-27a表达对猪成肌细胞的促分化作用。上述结果表明,miR-27a通过Akt/FoxO1信号通路抑制猪成肌细胞的分化。试验四Mi R-27a对猪肌纤维类型转化的影响及机理在本试验中,在猪成肌细胞诱导分化3天后转染miR-27a mimics及inhibitor,探究miR-27a在猪肌纤维类型转化中的作用,并进一步用WM及miR-27a inhibitor同时处理细胞,研究miR-27a在猪肌纤维类型转化中的作用是否通过Akt/FoxO1信号通路来实现。结果发现,过表达miR-27a显著降低MyHCIIa、MyHCIIx mRNA及慢肌蛋白表达量,显著提高快肌蛋白水平。而抑制miR-27a显著提高所有肌纤维亚型的m RNA水平及慢肌蛋白表达量,显著降低快肌蛋白水平。此外,过表达miR-27a显著降低P-FoxO1/FoxO1水平,显著提高FoxO1蛋白表达水平,而抑制miR-27a显著提高P-Akt/Akt水平,显著降低FoxO1蛋白水平。在转染miR-27a inhibitor同时用WM处理细胞,发现WM削弱了miR-27a对猪肌纤维类型转化的作用。上述结果表明,miR-27a通过Akt/FoxO1信号通路促进猪肌纤维类型由慢肌向快肌转化。试验五MiR-27a参与Leu诱导猪肌纤维类型转化本试验中,猪成肌细胞诱导分化3天后转染miR-27a mimics并同时添加Leu,探究Leu调控猪肌纤维类型转化是否需要miR-27a的参与。结果发现,Leu显著降低miR-27a的表达,显著提高MyHCI、MyHCIIa、MyHCIIx的m RNA及慢肌蛋白水平,显著降低MyHCIIb m RNA及快肌蛋白表达量,而过表达miR-27a削弱了Leu对猪纤维类型转化的影响。上述结果表明,miR-27a参与了Leu诱导的猪肌纤维类型转化。综上所述,本研究证实Leu通过Akt/FoxO1信号通路促进猪成肌细胞分化及肌纤维类型由快肌向慢肌转化,miR-27a通过Akt/FoxO1信号通路抑制猪成肌细胞分化和促进肌纤维类型组由慢肌向快肌转化,miR-27a参与了Leu诱导的猪肌纤维类型转化。